川崎病とL型菌の関連について L型菌ナノサイズ微小細胞が アジュバント効果を持つ可能性 1 L型菌が 粒子状アジュバントになる

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1 川崎病とL型菌の関連について L型菌ナノサイズ微小細胞が アジュバント効果を持つ可能性 1 L型菌が 粒子状アジュバントになる
可能性があるのではないか、 ということを ご報告いたします。 1

2 川崎病の病原体としてL型菌を検討する理由
①　Ｌ型菌は今だ十分には検討されていない ② 　病巣部からL型菌様の微生物が検出されている ③　ペニシリン系の抗生物質が無効である ④ 　川崎病は抗生物質の使用開始の頃より発生し始　　 　　め、日本に多い（L型菌増加と一致？）　 川崎病の病原体として L型菌は　いまだ十分には 検討されていないのでは、とおもいまして、 調べております。

3 これまでの結果 ① 細菌のHSP60はペリプラズムに局在し、L型菌では細胞表面、または外界に分泌される可能性がある (2008, 細菌学会）
②　 ③　 細菌のHSP60はペリプラズムに局在し、L型菌では細胞表面、または外界に分泌される可能性がある　(2008, 細菌学会） 　川崎病ではBCG接種部位の発赤が起こる事との関連 　（HSP60が関連すると考えられている） 化膿レンサ球菌のL型菌にはストレプトリジンO、ストレプトキナーゼを産生しない株が出現する(2010　細菌学会） 　川崎病患者にASLO、ASKが検出されない理由 化膿レンサ球菌のL型菌には親株より多くの ヒアルロニダーゼを産生する株がある　(2010　感染症学会） 　川崎病患者の病態と関連する可能性がある これまで報告したした結果を 簡単に述べますと HSP６０はL型菌では細胞表面または外界に放出される可能性がある と考えまして、 川崎病のBCG接種部位が発赤することと関連しているのではないか と考えています。 次に 溶連菌のL型菌ではストレプトリジン0とストレプトキナーゼを産生しない株が在ることを報告し、患者にアスロやASKが検出されないことと関連があるのではないかと考えています。 L型菌でヒアルロニデース蛋白が親株よりも多く産生されていることを 報告し、L型菌でも　病原性が強くなる部分もある　のではないかと考え、病態との関連を考えています。 、

4 L 型菌の特殊性 増殖過程で大小の細胞ができる 今回は L型菌の特殊性であります 増殖過程で大小の細胞ができることに注目しました
　増殖過程で大小の細胞ができる 今回は L型菌の特殊性であります 増殖過程で大小の細胞ができることに注目しました まず、その写真を見ていだだきますが、

5 Staphylococcus aureus L 型菌 Takahashi,T ら、１９８１より
これはコロニーです マイコプラズマと同様 目玉焼き状になり、 この濃い部分には微小細胞が見られ　寒天の中に 沈みこんでいきます。 大型の細胞は寒天表面を横に広がっていき、 100ミクロンに近いサイズも見られます 100μm Staphylococcus aureus　L 型菌 　　Takahashi,T　ら、１９８１より

6 Staphylococcus aureus L 型菌 Eda,T. ら、１９７７より
電顕で見てみますと これは江田先生らの黄色ブドウ球菌の報告ですが、 このように 大小様々な細胞がみられます。 1μm Staphylococcus aureus　L 型菌 　　Eda,T.　ら、１９７７より

7 Streptococcus pyogenes L 型菌 Eda,T. ら、１９７９より
1μm 菌種が違っても 大きな細胞と小さい細胞が できることはL型菌の特徴です。 Streptococcus pyogenes　L 型菌 　　Eda,T.　ら、１９７９より

8 Escherichia coli L型菌 Eda, T. ら、1976より
1μm グラム陰性菌でも同様です Escherichia coli L型菌 　　Eda, T.　ら、1976より

9 Brucella suis L 型菌 Slomska, J. S. ら、１９８２より
菌種が違っても同じです。 Brucella suis　L 型菌 　　Slomska, J. S.　ら、１９８２より

10 Proteus mirabilis L 型菌 Kroll, H. P. ら、１９８０より
ほとんどと 言っていいほど 多くの菌種のL型菌が 報告されています。 Proteus mirabilis　L 型菌 　　Kroll, H. P. ら、１９８０より

11 Streptococcus faecium L 型菌 Bibel,D. J. ら、１９７５より
このように 大きな細胞の中に ちいさい、むすめ細胞、娘細胞ができるのもL型菌の特徴です Streptococcus faecium　L 型菌 　　Bibel,D. J.　ら、１９７５より

12 Staphylococcus aureus L型菌 Yabu,K. ら、１９９１より
リゾチームやプロテアーゼのような 蛋白がありますと 一日で このような大型細胞が形成されます。 Staphylococcus aureus　L型菌 　　Yabu,K.　ら、１９９１より

13 Proteus mirabilis L型菌 Eda, T. ら、１９７８ より
小さい細胞は １００　ナノメーター以下のものまで 観察されています。 100 nm Proteus mirabilis　L型菌 　　Eda, T.　ら、１９７８ より

14 ポアサイズ100 nm のミリポアフィルターを通過した
化膿レンサ球菌 L 型菌 これは、 溶連菌のL型菌ですが ポアサイズ、100ナノメーターの ミリポアフィルターで 濾過しても このように沢山の 細胞が通過して きます。 1μｍ

15 Proteus mirabilis 4 16 (TOHRE EDA et al. 1978)
菌種 　　　　　　　　 大型細胞（ mm　）　微小細胞（　nm　） Proteus mirabilis 　　 (TOHRE EDA et al. 1978) Brucella suis 　　 (J.SCHMITT SLOMSKA et al.1982) Proteus mirabilis 　　 (HEIN-PETER KROLL et al. 1980) Escherichia coli 　　 (TOHRE EDA et al. 1976) Pseudomonas aeruginosa 　　 (EARL G.HUBERT et al. 1971) Streptomyces hygroscopicus 　　 (J. GUMPERT 1983) Bacillus licheniformis 　　 (PRISCILLA B.WYRICK et al. 1973) group B Streptococcus 　　 ( N.C. CHURLOVA et al. 1986) Streptococcus pyogenes 　　 (TOHRE EDA et al. 1979) Streptococcus faecalis 　　 (MARY T.GREEN et al. 1974) Staphylococcus aureus 　　 (TOHRE EDA et al. 1977) Staphylococcus aureus 　　　 (TOYOZOH TAKAHASHI et al. 1981) Streptococcus faecium 　　 ( DAVID J BIBEL et al. 1975) 報告されている L型菌のサイズを 数値で見てみますと 大型細胞は　１００　ミクロンの大きさから 微小細胞は　　１６　ナノメートルまで観察されています。

16 L型菌のサイズ L型菌のサイズは粒子状アジュバントになりうる ウイルス 20～300nm 細 菌（野生型） 0.5～10μm
細　菌（野生型） 0.5～10μm アジュバント粒子 20～500nm 原　虫 １～60μm L　型　菌 16 nm～100μm そうしますと L型菌のサイズというのは このように ウイルス　サイズ　から 寄生虫の原虫のサイズ、まであり、 アジュバントとして用いられている粒子もサイズも この中に入ります。 従って L型菌は、まず、サイズの上では 粒子状アジュバントになりうる、ということになります L型菌のサイズは粒子状アジュバントになりうる

17 Emulsion of water-in-oil
ちなみに、これは 有名な、フロイント　アジュバントの論文に でてくる　Water in oil の図です。 オイルアジュバントはこのような、大小の粒子 でできていることを しめしています Freund, J., and Bonanto,M.V.: J.Immunol., 48: , 1944より

18 L型菌細胞への蛋白等の吸着について ウシ胎児血清１００％での化膿レンサ球菌124L株の培養 L-C株 124L株
アジュバントになるには 抗原を結合する性質が無くてはなりません そこで、今度は、 L型菌細胞に蛋白等が吸着するか、 ということを、調べてみました。 これは、血清のロットによっては、 L型菌も野生型の菌も増殖する場合があって その場合に、このように、L型菌のみ赤っぽい色が 付いて着ました。普通の菌や細胞壁が残っていると思われる L型菌はもとの　白い色でした。 これは、何か培地成分が菌体表面についてきた と思いまして、、、 化膿レンサ球菌124 L 株のみ菌体沈査に色の変化が見られた

19 培地成分のアルブミンはL型菌に吸着するか
菌株　化膿レンサ球菌　L 型菌: 124 L 株、 　　　　　　　　　 　野生型: 124 P 株(親株）K6169 株 培地　Ｌ型菌用液体培地　 　　　brain heart infusion broth 　　　0.5% yeast extract 　　　4% NaCl 　　　10% FBS　　　　　 培養　37℃　好気　静置培養 アルブミン吸着の確認 　　　全菌体成分に対する、sheep anti-bovine albumin antibody (Bethyl Lab. Inc.,A10-113A）を用いて ウエスタンブロッティングを行った。 アルブミンを調べて見ました。 市販の抗　アルブミンポリクローナル抗体を用いた ウエスタンブロッティングで 血清加培地で培養した L型菌を 調べてみました。

20 L 型菌株には、 野生型株より多くのアルブミンが検出された
Sheep anti-bovine albumin antibody によるウエスタンブロッティング 94- 67- 43- １ ２ ３ kDa ４ １. アルブミン ２．K6169 株 (野生型） ３．１２４ P 株 (野生型） ４．１２４ L 株 ( L 型） １　アルブミン蛋白です。 ２は　野生型株 ３は　このL型菌の親株の野生型です ４が　L型菌です。 この様に、 野生型にはバンドが見られませんが L型菌にはバンドが見られます。 L型菌では微小細胞が多いので、全体の 表面積は野生型より、がかなり大きくなると思われますので 野生型との定量的な比較は正確ではないかも知れません この差も、そのせいかもしれませんが、 しかし、L型菌にアルブミンが吸着してくることは 示唆されるト思います。 細胞の洗浄を強くした場合は このように、バンドが薄くなりますので、それほど 強い結合ではないように思います。 L 型菌株には、 野生型株より多くのアルブミンが検出された

21 マイコプラズマでも、培地血清蛋白が吸着することが報告されている
目的は違いますが、この論文でも、 L型菌に似た マイコプラズマの 細胞表面に培地成分のアルブミンや他の蛋白が強く結合して、 かなり洗浄しても、落ちない、 ということが報告されていまして、 L型菌でも、同様に外から来る 蛋白等を吸着する性質が あるのではないか と おもわれますす。 マイコプラズマでも、培地血清蛋白が吸着することが報告されている

22 L型菌のアジュバントサイズの微粒子表面に 蛋白等の抗原物質を吸着する性質があれば、 生体内で 粒子状アジュバントとして作用する可能性がある
蛋白等の抗原物質を吸着する性質があれば、　 生体内で 粒子状アジュバントとして作用する可能性がある アジュバントサイズの微粒子であるウイルスも その表面に抗原物質を吸着する性質があれば、 　生体内で 粒子状アジュバントになる可能性があるか? そこで、 L型菌のアジュバントサイズの微粒子表面に蛋白等の抗原を吸着する性質があれば、 生体内で　アジュバントとして作用するのではないか、 と 考える訳ですが、 では、ウイルスも アジュバントサイズであるので 、 その表面に抗原を吸着した場合は アジュバントとして作用するのか、 ということになりますが、 これを　調べて見ますと、、、、

23 （化学及血清療法研究所 特許出願書 ２００９ より） ウイルス粒子も （粒子状）アジュバントになる
不活化日本脳炎ウイルス粒子をアジュバントとして使用する方法 これは、化血研の先生がたが 昨年、出されました特許申請ですが 不活化日本脳炎ウイルス粒子をアジュバントとして使用する方法 というタイトルになっています。 これを拝見いたしましたところ、 このウイルス粒子を抗原液に加えて接種することで　 それらの抗原に対する、より早く強い免疫が誘導された､　 という多くの実験をされていまして、 私の理解するところでは、ウイルス粒子が　 粒子状アジュバントとして働いたものと 思われます。 課題を解決するための手段[0010][3]　不活化日本脳炎ウイルスが粒子状構造であることを特徴とする （化学及血清療法研究所 特許出願書　２００９　より） ウイルス粒子も　（粒子状）アジュバントになる

24 L型菌の動物感染実験 ● 黄色ブドウ球菌、化膿レンサ球菌のL型菌をラットの肺、 腹腔に接種、３０日間観察
　野生型より強い炎症反応を引き起こした 　　　　　　　　　　　　　　（Lilia Michailovaら、2000、2006） 化膿レンサ球菌 L型菌をマウスの腹腔に接種し１年間観察 L型菌の抗原は一年間検出。　 L型菌の抗原は、肝臓、腎臓、心臓、脾臓の全てに出現。 全ての組織の血管で反応が見られ、壊死や出血性病変が見られた。 心臓では、心内膜、心外膜、間質組織、心筋繊維、特に血管周辺部に 見られ、強い血管炎を示し、瘤状の拡張 fibrinoid swelling を形成した L型菌はマクロファージの細胞内外に見られる 　　　　　　（G. Kaganら、1976） ● では、実際に L型菌を動物に接種して確かめればよい、と思うのですが、 すでに、幾つかの実験がありまして、 これは、ブ菌と溶連菌のL型菌をラットに接種して、一ヶ月観察したものです、 親株は１５日ほどで、体内からは消滅しますが、 L型菌は最後まで回収されます。 L型菌はマクロファージ内で生存し、持続感染するのが一つの特性です。 こちらは、マウスに接種して一年間観察した実験です。 一年間の持続感染が確認されています。 色んな臓器で検出されますが 血管の反応は全身の血管で見られ、 心臓への集積が強く、強い血管炎を起こして､こぶ状の拡張部分を形成することが観察されるなど、 川崎病の病態とかなり類似していると、思われます。

25 結 果 と 考 察 １. L型菌の細胞サイズ 微小細胞 16 nm （ ウイルスサイズ ） 50～500 nm （ アジュバントサイズ ）
結　果　と　考　察 １.　L型菌の細胞サイズ 　 微小細胞　　　　　　　　16　nm 　 　（ ウイルスサイズ ） 　 50～500　nm 　 （ アジュバントサイズ ）　　 　　　　　　　　　　500～10000　nm 　 （ 細菌サイズ ）　　　 　　大型細胞　　　　　100000　nm 　　 （ 原虫サイズ ） ２．L型菌の細胞膜は外来性の蛋白等を吸着する可能性がある｡ ３．Ｌ型菌の微小細胞が粒子状アジュバントとして作用する可能性がある。 ４．この機序によって、川崎病等、膠原病の多様な免疫反応と　　病因特定の困難さが生じている可能性がある。 　以上、まとめますと、 L型菌の細胞サイズは ウイルスサイズから、寄生虫サイズまで、生じ このような粒子が生体内で生じる　という影響も大きいと思われますが、 さらに、。 その細胞表面に蛋白等が結合した場合は、 このL型菌がアジュバントとして作用するのではないかと考えられました　 川崎病を　L型菌によるアジュバント病、 また、一部分は、他のアジュバント物質によるアジュバント病、 という風にとらえますと、 これまで、候補として上がってきた 原因微生物の多様さ　や アジュバント病として、カーペット洗剤説などが 原因の一部として、理解できるのではないか と思われます。 以上です。 25

26 CD14+モノサイト/マクロファージ数が増加する。
川崎病の急性期抹消血では CD14+モノサイト/マクロファージ数が増加する。 化膿レンサ球菌L型菌をラット腹腔に接種した場合、 マクロファージ、モノサイトが 野生型より激しく増加する 　　（Lilia Michailova　ら、２０００）

27 推測される Ｌ 型菌の作用 アジュバント作用 擬似ウイルス 毛細血管の塞栓 マクロピノサイトーシス 結合組織への侵襲 免疫複合体形成
擬似寄生虫 持続・潜伏感染 血管内皮細胞への吸着 細胞外増殖 貪食細胞内増殖

28 L型菌が疑われている膠原病 ●サルコイドーシス ●全身性エリテマトーデス
Etiology of sarcoidosis : the role of Propionibacterium acnes.　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(Eishi Y, ら　２００３） Histologic obserbations of variably acid-fast pleomorphic bacteria in systemic sarcoidosis (Cantwell AR Jr. 1982) ●全身性エリテマトーデス Histologic Observation of Coccoid Forms Suggestive of Cell Wall Deficient Bacteria in Cutaneous and Systemic Lupus Erythematosus 　　　　　　　　 　　　 　　　　　 (Cantwell AR Jr. ら　1982)

29 × 多くの菌種が L 型菌に変化する 個々のL型菌は様々な変化ができる ウイルスサイズ、 細菌サイズ、 寄生虫サイズ 細胞内寄生 細胞外寄生
ウイルスサイズ、　細菌サイズ、　寄生虫サイズ 細胞内寄生　　　　　　　細胞外寄生 持続感染　　　　　　　 　潜伏感染 増殖性細胞　　　　　　　非増殖性細胞(100nm以下） 細胞壁成分あり　　　　 細胞壁成分なし L型菌相　　　　　　　　　野生型相(親株への復帰）　 ×　　　 多くの菌種が L 型菌に変化する