形質転換 実施：2011年12月.

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1 形質転換 実施：2011年12月

2 目的 細胞が外部にある特定のDNAを取り込み，そのDNAの遺 伝子が発現することを確認する。大腸菌を用いて観察する 教材
BIO-RAD「Biotechnology Explorerキット」を使用　 目的

3 準備 器具 ウオーターバス(42℃) インキュベーター(37℃) 氷
　器具　 ウオーターバス(42℃)　インキュベーター(37℃)　　氷 ピペット　植付け用ループ　緑と青のチューブ　チューブ立て(キッドに同包)　油性ペン 　薬品　 大腸菌スタータープレート(LB)１枚　 pGLOプラスミド溶液　１本 寒天培地(LB×１　LB/ amp×２ LB/amp/ara×１)　計４枚 形質転換用溶液(Bu)　１本 LB培地(液体)　１本

4 遺伝子組み換えの原理（１）

5 遺伝子組み換えの原理（２）

6 実験材料 材料は氷冷しておく。

7 寒天培地 (A) ＋DNA LB／amp （B） ＋DNA LB／amp／ara (C) －DNA LB／amp （D） －DNA LB
寒天培地は事前に準備しておく

8 実験器具(1) マーカー以外の器具は，実験キッドに同包されたものを使用する。

9 実験器具(2)

10 遺伝子組み換えの基本 １ 導入したい遺伝子を含むDNAを手に入れる。 ２ 導入したい遺伝子をベクターに組み込む。
２　導入したい遺伝子をベクターに組み込む。 ３　ベクターを細胞に導入する。 ４　遺伝子組み換えに成功した細胞の選別。

11 実験手順（１） １ 緑チューブのフタに 「＋DNA」 ，青チューブの フタに 「－DNA」 と記入する。
２　緑と青チューブに形質転換溶液（Bu）を250μℓず つ加え，冷却する。 ここでのDNAはプラスミドのことです。 両方同じピペットを使用できる。

12 実験手順（２） ３ 形質転換される大腸菌を緑と青チューブに溶解 させ，氷冷する。 大腸菌を溶かし入れたら，液層に触らないこと。
３　形質転換される大腸菌を緑と青チューブに溶解 させ，氷冷する。 大腸菌スタータープレート（LB）のコロニーを植付け用ループですくい取り，緑チューブに溶かし入れる。 青いチューブも同様に行う。 大腸菌を溶かし入れたら，液層に触らないこと。 温めないようにする。

13 実験手順（３） ４ pGLOプラスミド溶液を緑（＋）チューブのみに加 える。

14 実験手順（４） ５ 緑と青チューブを10分間氷冷する。 ６ 寒天培地４枚のフタに次のサンプル名を記入す る。 それぞれに
５　緑と青チューブを10分間氷冷する。 ６　寒天培地４枚のフタに次のサンプル名を記入す る。 それぞれに A+　B+　C-　D-と記入する。

15 実験手順（５） ７ ヒートショック：冷却による遺伝子の導入 DNAの細胞膜を通り抜ける割合を増加させている。
７　ヒートショック：冷却による遺伝子の導入 緑・青チューブをチューブ立てに立て，ウオーターバス（42℃）に，50秒浸ける。 50秒後すぐに，氷に戻し2分間冷やす。温度変化により，DNAを閉じ込める。 DNAの細胞膜を通り抜ける割合を増加させている。

16 実験手順（６） ８ 氷中から緑・青チューブを取り出し，LB培地（液 体）をそれぞれ250μLずつ加える。 ９ 10分間室温で放置する。
９　10分間室温で放置する。 　 緑・青チューブの中身は全く異なるものになっている。 LB培地を加えるときは別々のピペットを使用する。 ヒートショックで弱った大腸菌に栄養を与える。

17 実験手順（７） 10 形質転換した大腸菌を培地に移し，培養する。 緑・青チューブをタッピングして溶液を混合する。
10　形質転換した大腸菌を培地に移し，培養する。　 緑・青チューブをタッピングして溶液を混合する。 （大腸菌がチューブ内に沈んでいるため） 各チューブの大腸菌を以下のように各培地に滴下する。 【緑チューブ（＋DNA）】 　　LB/amp　　　　　（A） LB/amp/ara　　　（B） 【青チューブ（－DNA）】 　　LB　　　　（C） 　　LB/amp　（D）

18 実験手順（８） 11 滴下した大腸菌の塗布。 操作はプレート１枚ずつ行い，新しいプレート毎に，新しいループを使用すること。
11　滴下した大腸菌の塗布。　 新しい植付け用ループを使い大腸菌サンプルを広げます。ループの輪の部分を培地表面と平行に滑らせるように、手早く、プレート表面にできるだけ広い範囲に広げたら、蓋を閉めます。 操作はプレート１枚ずつ行い，新しいプレート毎に，新しいループを使用すること。

19 実験手順（９） 12 37℃のインキュベーターで1週間培養する。
12　37℃のインキュベーターで1週間培養する。　 ラップで包んだ状態で30分程度置いておきます。その間に，培地に大腸菌がなじみます。 プレートは上下逆にして，インキュベーターにいれます。 上下逆にすることで，蓋からの菌や水滴の落下によるコンタミネーションを防ぐことができます。

20 結果(可視光線)

21 結果(UV照射)

22 結果 結果の一例を表示します。 培養条件 37℃ 培養期間 3～4日 (A) ＋DNA LB/amp （B） ＋DNA LB／amp／ara
　培養条件　37℃　　培養期間　3～4日 (A)　　＋DNA　　LB/amp （B）　 ＋DNA　　　LB／amp／ara 　　コロニ－　346個　　 　　蛍光　　無 　　コロニ－　440個 　　蛍光　　有 (C)　 －DNA　　LB／amp　 （D）　　－DNA　　LB 　　コロニ－　0個 　　コロニ－　　∞個　

23 ポイントやトラブルシューティング 実験前後には，手を70%エタノールで消毒する。この時 実験台も拭き，それが乾いてから実験を開始する。
チューブの持ち方，ループやピペットの取り出し方など， 器具の取扱いに気をつける。 各実験段階で，大腸菌の状態を把握しておく。 使用した使い捨て器具・試薬は机の上などに置かず， 所定のゴミバックに入れる。大腸菌に触れなかったもの は普通ゴミとして処分する。 皮膚や衣類が，万が一大腸菌に触れた場合は70%エタ ノールで殺菌して，水で洗い流す。 実験室の扉・窓は閉じておく。 白衣の着用。

24 実験を成功させるための留意点 実験前 実験中 実験後 ・形質転換用溶液（Bu），LB培地，ﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞ溶液は氷冷しておく。
・植付け用ループやピペットの取り換えに注意する。 ・ヒートショックの時間を厳密に計る。 ・大腸菌の状態を考え，タッピングをむやみに行わない。 実験後 ・使用した器具・試薬の処理。 ・実験終了後は，手・机上をアルコール消毒する。

25 実験に出てくる用語解説（１） pGLO：GFP遺伝子とアンピシリン耐性であるβ-ラクタマ－ゼ遺伝 子を含むプラスミド。
DNAリガーゼ：組み込んだDNAを組み込まれたDNAと結合させる酵素。 Green　Fluorescent　Protein：Green　Fluorescent　Protein（GFP）は生 物蛍光を発するオワンクラゲ、Aequreavictoriaから単離されたタンパク質 です。GFP遺伝子は最近になってクローン化されました。特徴的な構造ゆえ に、紫外線を照射するとそのエネルギーを吸収し、吸収されたエネルギーは 緑色のきれいな光となって放出されます。 pGLO：GFP遺伝子とアンピシリン耐性であるβ-ラクタマ－ゼ遺伝 子を含むプラスミド。 アラビノース：甘味料の１種。バクテリアが通常食物として利用する。 アンピシリン：抗生物質の１種。 形質転換用緩衝液 ：形質転換用緩衝液 （50mM　CaCl2、 pH7.4）中のCa2+イオンがDNA（plasmid）の負電荷（リン酸基を 持つため）を中和し、同じく負電荷を持つ、細胞膜のリン脂質との 静電的反発をやわらげます。そして、DNAは細胞膜の外側から内 側に通り抜けることができるのです。

26 実験に出てくる用語解説（２） コロニー：寒天培地上で生育した、同じ遺伝子を持つ細胞の凝集 塊。一つのコロニーにあるすべての細胞は同じ遺伝子を持つので、 クローンと呼ばれます。 培地：液体や寒天（LB）培地は，バクテリアの生育をサポートする 固形物質。炭水化物やアミノ酸、ヌクレオチド、無機塩類、ビタミン を含みます。 ヒートショック：ヒートショックを与えることにより、DNAの細胞膜を通り 抜ける割合が増加します。細胞の種類により異なります。 プラスミド：細菌などに存在する主のDNAとは別のDNA。環状の DNAで、自己複製ができます。抗生物質耐性タンパク質やGFPの ようなクローン化された他の生物の遺伝子を組み込むことがでま す。 ベクター：運び屋DNA。今回のプラスミドのように、他の生物からの DNA断片を組み込まれ、宿主となる細胞に導入される、自己複製す るDNA分子。

27 器具の説明 ピペット：使い捨てピペットは，減菌した状態で１本ず つ袋に入っている。直前に袋から出し使用する。 100μL～1mLを採集できる。

28 ループの使い方 ループは，減菌した状態で袋に入っている。直前に袋 から出し使用する。
菌を塗布するときは，ループ先の輪の部分を培地表 面と平衡に滑らせるように，手早くプレート表面をでき るだけ広範囲に広げる（右図）。

29 コロニーの数え方 裏返して数える。 コロニー数が多い場合，4等分(8等分)してサインペンでマークして いく。それぞれ30～50個までは数えられ，4倍(8倍)する。 右端図のように全面に生えている場合は∞とする。