Hyperglycemia Promotes Myelopoiesis Cell Metabolism, May, 2013 Hyperglycemia Promotes Myelopoiesis and Impairs the Resolution of Atherosclerosis 高血糖は骨髄造血を促進しアテローム性動脈硬化症の回復に障害をきたす 2015/11/30 M2　瀧井靖歩

骨髄造血について 骨髄造血： 骨髄に存在する 造血幹細胞が、 白血球・赤血球・ HSPC:造血幹細胞 骨髄 CMP: 骨髄系前駆細胞 リンパ球系前駆細胞 骨髄造血： 骨髄に存在する 造血幹細胞が、 白血球・赤血球・ リンパ球・血小板・肥満細胞・樹状細胞などの血球系の細胞に分化すること。 赤芽球系前駆細胞 GMP: 顆粒球／マクロファージ前駆細胞 赤血球 リンパ 組織 樹状細胞 巨核球 血液 血小板 骨髄芽球 単球 好塩基球 （R&D Systems HPより 一部改変） 単球由来 樹状細胞 マクロファージ 好中球 好酸球

アテローム性動脈硬化症について ケモカイン 単球 マクロファージ 接着分子 外膜 中膜 血管内皮細胞 接着 プラーク形成 浸潤 血管内皮細胞 遊走 分化 泡沫化 中膜 外膜

？ 背景と目的 白血球の増加 糖尿病 プラークの拡大 高血糖 脂質異常症など 糖尿病患者において白血球数が増加し、アテローム性動脈硬化症のリスク上昇に関わる。 (Am. J. Epidemiol., 2002) 血中の単球や好中球の増加は、単球／好中球のプラークへの侵入の増加やプラークの拡大を促進する。(J. Clin. Invest., 2007) 糖尿病はインスリンシグナル異常や、脂質異常症、高血糖などのさまざまな代謝異常に関わっている。 しかし、これらの代謝異常がどのように白血球の増加に関わっているかは明らかでない。 白血球の増加 糖尿病 プラークの拡大 高血糖 脂質異常症など ？ 冠動脈疾患→心臓への血流が一部または完全に遮断された状態を指す。その原因はほとんどがアテローム性動脈硬化症と考えられている。 ①　糖尿病における単球や好中球の増加メカニズムを解明する

背景と目的 プラークの 退縮 血中コレステロールの低下 糖尿病 ←メカニズム？ ヒトで血漿中のコレステロール値を下げることで、プラークが退縮する。 (N. Engl. J. Med., 2011) 筆者らは以前の研究で、糖尿病を発症したマウスではプラークの退縮が抑制されることを確認した。(Diabetes, 2011) →メカニズムは明らかになっていない。 プラークの 退縮 血中コレステロールの低下 糖尿病 ←メカニズム？ ②　糖尿病とアテローム性動脈硬化症の関連性を、特にプラークの退縮に着目して評価する。 ③　1型糖尿病患者を対象として、ヒトでもマウスと同様のメカニズムが働いているかを確かめる。

？ 糖尿病における単球や好中球の増加メカニズムを解明する 白血球の増加 糖尿病 プラークの拡大 高血糖 脂質異常症など 高血糖とアテローム性動脈硬化症の関連性を、特にプラークの退縮に着目して評価する。 1型糖尿病患者を対象として、ヒトでもマウスと同様のメカニズムが働いているかを確かめる。

白血球の増加は高血糖に依存する WTとSTZ糖尿病モデルマウスを普通食で4週間飼育し、血中の白血球を採取 蛍光標識された抗体(anti CD45, anti Ly6C/G, anti CD115)で白血球を染色 フローサイトメトリーで測定 ※SGLT2i (Sodium Glucose Cotransporter 2 inhibitor) 尿細管からのグルコースの再吸収を阻害する。 →尿中へのグルコースの排出を増加させることで 血中グルコースを減少させる。 単球 好中球 CD45 High Ly6C/G or Low CD115 ※Ly6-C：骨髄細胞分化抗原 Ly6-Chigh単球はM1 Mφへ、Ly6-Clow単球はM2 Mφへ分化する。 単球 好中球 サプリメントで血糖値が上がって下がることを見せる必要があるかも。

高血糖によって糖尿病マウスにおける血中白血球数が増加した。 白血球の増加は高血糖に依存する WTとAkita糖尿病モデルマウスを普通食で4週間飼育し、血中の白血球を採取 蛍光標識された抗体(anti CD45, anti Ly6C/G, anti CD115)で白血球を染色 フローサイトメトリーで測定 ※SGLT2i (Sodium Glucose Cotransporter 2 inhibitor) 尿細管からのグルコースの再吸収を阻害する。 →尿中へのグルコースの排出を増加させることで 血中グルコースを減少させる。 単球 好中球 CD45 High Ly6C/G or Low CD115 ※Ly6-C：骨髄細胞分化抗原 Ly6-Chigh単球はM1 Mφへ、Ly6-Clow単球はM2 Mφへ分化する。 サプリメントで血糖値が上がって下がることを見せる必要があるかも。 高血糖によって糖尿病マウスにおける血中白血球数が増加した。

高血糖によって糖尿病マウスにおける骨髄造血が促進した。 骨髄造血の増加は高血糖に起因する WTとSTZ、Akita糖尿病モデルマウスを普通食で4週間飼育し、骨髄中のHSPC、CMP、GMPの数をフローサイトメトリーで測定した。 血球の分化 HSPC：造血幹細胞 CMP：骨髄系前駆細胞 GMP 顆粒球／ マクロファージ 前駆細胞 （R&D Systems HPより一部改変） 高血糖によって糖尿病マウスにおける骨髄造血が促進した。

高血糖によって糖尿病マウスにおける骨髄造血が促進した。 骨髄造血の増加は高血糖に起因する 野生型とSTZ、Akita糖尿病モデルマウスを普通食で4週間飼育し、骨髄中のHSPC、CMP、GMPの細胞周期を測定した。 DAPIで染色 ↓ フローサイトメトリーで蛍光強度を測定 細胞周期について 間期 分裂期 G1期 S期 G2期 M期 2 核当たりのDNA量 1 高血糖によって糖尿病マウスにおける骨髄造血が促進した。

骨髄造血に 関わる因子 について （R&D Systems HPより 一部改変） HSPC:造血幹細胞 CMP: 骨髄系前駆細胞 リンパ球系前駆細胞 赤芽球系前駆細胞 GMP: 顆粒球／マクロファージ前駆細胞 赤血球 樹状細胞 巨核球 血小板 骨髄芽球 骨髄造血には、血漿中のG-CSF、M-CSF、GM-CSFが関わる 筆者らは実験に用いたマウスの血漿中において、G-CSF濃度だけが上昇していることを確認した。 単球 好塩基球 （R&D Systems HPより 一部改変） 単球由来 樹状細胞 マクロファージ 好中球 好酸球

骨髄造血はS100A8/S100A9によって誘導される Supplemental Information 血中、骨髄中の骨髄細胞におけるS100A8、S100A9、HMGB-1のmRNA発現量

S100A8/A9、HMGB-1について S100A8/A9複合体（Calprotectin） リウマチ様関節炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー性皮膚炎などの慢性炎症疾患の発症に関与すると考えられている。 HMGB-1 (High Mobility Group Box 1) 主に細胞の核に存在する。 p53やNF-κBなどの転写因子の機能発現に関わるDNA結合タンパク質。 マクロファージや壊死細胞から放出され、RAGEやTLRのリガンドとして作用する。 細胞膜にも存在が確認されており、amphoterinともよばれる。 リガンドとして作用 HMGB-1　TLR2も受容する 脊椎動物の細胞質に特有のタンパク質。 カルシウム結合ドメインを持ち、細胞内カルシウムイオン濃度を一定に保つバッファーとして働く。 RAGE (Receptor for Advanced Glycation End Products） AGEs の受容体として発見された、膜貫通型レセプター。 AGEs以外にも内因性のタンパク質もリガンドとして認識する、パターン認識受容体。 リガンド結合により、炎症やアポトーシスなど様々な反応を誘導する。

骨髄造血はS100A8/S100A9によって誘導される (A)野生型とSTZマウスにおける血漿中のS100A8/A9をELISAで定量した。 (B)好中球 (Neutrophils)におけるS100A8、S100A9、HMGB-1のmRNA発現量を評価した。 Supplemental Information 血中、骨髄中の骨髄細胞におけるS100A8、S100A9、HMGB-1のmRNA発現量 Mono Neutro T-cells B-cells Macs CMPs GMPs Circulating Cells BM Cells

骨髄造血はS100A8/S100A9によって誘導される (C)野生型マウス由来の骨髄中の細胞をS100A8/S100A9複合体とEdU (10 μM)を含んだ 　　High Glucose (25 mM)培地で16時間培養した後、GMPの細胞増殖を評価した。 (D,E)野生型マウスにS100A8/S100A9複合体(20 μg/kg/day)を3日間経口投与し、血中の単球、 骨髄中のHSPC, CMP, GMPの数を評価した。 ※EdU 5-Ethynyl-2´-deoxyuridine 新規のDNA合成の際に チミジンの代わりにDNAに 取り込まれる。 Supplemental Information 同様の実験をHMGB-1でも行った。 S100A8/A9が骨髄細胞の増殖を促進するかどうかを調べる。 S100A8/A9は骨髄細胞の増殖を促進する。

糖尿病発症時の骨髄造血の促進にはS100A8/A9が必要 骨髄造血はS100A8/S100A9によって誘導される S100A9KOマウス由来の骨髄を移植したマウスにて糖尿病発症時の骨髄造血を評価した。 糖尿病発症時の骨髄造血の促進にはS100A8/A9が必要

S100A8/S100A9に誘導される骨髄造血はRAGEに依存する (A)マウスから採取した骨髄中の細胞をS100A8/S100A9複合体とEdU (10 μM)を含んだ 　　High Glucose (25 mM)培地で16時間培養した後、GMPの細胞増殖を評価した。 (B) STZで糖尿病を誘発したWT、RAGEKOマウスを4週間飼育した後、血中の白血球数を測　 　　定した。 (C) WTマウスを用いてHSPC, CMP, GMPにおける細胞表面のRAGE発現を評価した。 MYD88はTLRのシグナル伝達に必要なタンパク質。 糖尿病発症時の骨髄造血の促進には RAGEが必要

S100A8/S100A9に誘導される骨髄造血はRAGEに依存する RAGEKOマウス由来の骨髄を移植したマウスにて糖尿病発症時の骨髄造血を評価した。 Supplemental Information 同様の実験を Myd88KOマウスでも行った。 骨髄細胞に発現しているRAGEの役割を調べる。 S100A8/A9が骨髄細胞表面のRAGEを介して作用することにより、 糖尿病マウスにおける骨髄造血を促進した。

RAGE依存的骨髄造血は細胞自律的でない RAGEを介した骨髄造血の促進は細胞非自立的である。 (H-K)競合的骨髄再構築法を用いて、糖尿病発症時の各種骨髄細胞の数と細胞周期を測定した。 骨髄のRAGEが関わっていることは分かった→自律的か？ RAGEを介した骨髄造血の促進は細胞非自立的である。

RAGE依存的骨髄造血は細胞自律的でない NF-κB阻害により、S100A8/S100Aに誘導されるGMP増殖が抑制された。 (M) マウスから採取した骨髄細胞をS100A8/S100A9複合体 (2 µg/mL)を含むHigh 　　　Glucose (25 mM)培地で16時間培養した後、GMPの細胞増殖を評価した。 ※SN50: NF-κB inhibitor NF-κB阻害により、S100A8/S100Aに誘導されるGMP増殖が抑制された。

NF-κBを介したRAGEシグナルはサイトカイン産生を促進する (N) マウスから採取した造血幹細胞と前駆細胞をS100A8/S100A9複合体 (2 µg/mL)を 　　 含むHigh Glucose (25 mM)培地で16時間培養した後、血球の増殖や分化に関わる 　　 サイトカインのmRNA発現量を評価した。 (O)マウスから採取した骨髄細胞をS100A8/S100A9複合体を含んだHigh Glucose (25 　　 mM)培地で16時間培養した後、GMPの細胞増殖を評価した。 S100A8/S100A9はRAGE/NF-κB経路を介してサイトカイン産生を誘導し骨髄造血を促進する。

骨髄造血に 関わる因子 について （R&D Systems HPより 一部改変） HSPC:造血幹細胞 CMP: 骨髄系前駆細胞 リンパ球系前駆細胞 赤芽球系前駆細胞 GMP: 顆粒球／マクロファージ前駆細胞 赤血球 樹状細胞 巨核球 血小板 骨髄芽球 骨髄造血には、血漿中のG-CSF、M-CSF、GM-CSFが関わる 筆者らは実験に用いたマウスの血漿中において、G-CSF濃度だけが上昇していることを確認した。 単球 好塩基球 （R&D Systems HPより 一部改変） 単球由来 樹状細胞 マクロファージ 好中球 好酸球

糖尿病マウスにおいて好中球が骨髄造血を引き起こす WTマウスとSTZ糖尿病マウスを用いて、好中球枯渇実験を行い、 (A)血中の好中球の数、(B)単球の数、(C)S100A8/A9濃度を評価した。 Supplemental Information 血中、骨髄中の骨髄細胞におけるS100A8、S100A9のmRNA発現量 Mono Neutro T-cells B-cells Macs CMPs GMPs Circulating Cells BM Cells S100A8/A9が骨髄造血に関わるのは分かった S100A8/A9の主な産生源は好中球 →じゃあ好中球が骨髄造血に与える影響を調べよう。

糖尿病マウスにおいて好中球が骨髄造血を引き起こす 好中球が産生するS100A8/S100A9が骨髄造血を誘導している。 WTマウスとSTZ糖尿病マウスを用いて、好中球枯渇実験を行い、 (D,E)CMP、GMPの数と細胞周期、(F)CMPにおけるRAGEmRNA発現量を評価した。 ここまでで目的１終わり 好中球が産生するS100A8/S100A9が骨髄造血を誘導している。

糖尿病における単球や好中球の増加メカニズムを解明する Hyperglycemia 高血糖とアテローム性動脈硬化症の関連性を、特に動脈硬化巣の退縮に着目して評価する。 1型糖尿病患者を対象として、ヒトでもマウスと同様のメカニズムが働いているかを確かめる。

糖尿病における単球や好中球の増加メカニズムを解明する 高血糖とアテローム性動脈硬化症の関連性を、特にプラークの退縮に着目して評価する。 プラークの 退縮 血中コレステロールの低下 糖尿病 ←メカニズム？ 1型糖尿病患者を対象として、ヒトでもマウスと同様のメカニズムが働いているかを確かめる。

血糖値の低下は動脈硬化巣の退縮を促進する LdlrKOマウス(8-12週齢)を用いて、動脈硬化巣退縮試験を行った。 (B)血中グルコース濃度、コレステロール濃度を測定 (C)血中の単球、好中球の数を測定 Supplemental Information 目的２ 高血糖と、動脈硬化の関係性、特に、動脈硬化巣の退縮の抑制の可能性について

血糖値の低下は動脈硬化巣の退縮を促進する (D)動脈硬化巣の面積（Oil Red O染色） (E)動脈硬化巣への脂質蓄積(Oil Red O染色） (F)動脈硬化巣へのマクロファージの浸潤（免疫染色） を評価した。 CD68はマクロファージのマーカー

血糖値の低下は動脈硬化巣の退縮を促進する 血糖値の低下は動脈硬化巣の退縮、単球／マクロファージの浸潤の改善を促進した。 (G)単球の接着試験、(H)単球のCD11b活性の測定、(I)単球の遊走試験 （J）動脈硬化巣への単球のリクルートの評価を行った。 ※CD11b 単球・好中球に発現し、 血管内皮細胞との接着に関わる。 接着分子Mac-1の構成要素であり、 ICAM-1をリガンドとする。 緑: Ly6-C抗体 （単球） 青: ヘキスト染色（核） G　単球を取ってきて蛍光染色→HUVECの上に入れる→蛍光強度 H　Ly6-C　High　単球上のCD11bの発現を測定 I　　トランスウェルの上に単球、下にCCL2=MCP-1→下に遊走した数を、電気抵抗にて測定。 J　遊走を組織中で評価。 血糖値の低下は動脈硬化巣の退縮、単球／マクロファージの浸潤の改善を促進した。

持続的な単球のリクルートが糖尿病における動脈硬化巣の 退縮異常を引き起こす 動脈硬化モデルマウスの動脈を糖尿病モデルマウスに移植し、単球の動態を評価した。 血糖値が動脈硬化巣の退縮に関わることが示された。 血糖値が単球の動態に関わっていることも示された。 →血糖値と動脈硬化巣の退縮の間にあるメカニズムを単球に着目して評価する。 血糖値を低下させることで動脈への単球のリクルートや浸潤が改善した。 また、動脈硬化巣からのマクロファージの遊出には影響を与えなかった。

持続的な単球のリクルートが糖尿病における動脈硬化巣の退縮異常を引き起こす 高血糖状態では、持続的に単球のリクルートが促進している。 EdUもしくは蛍光ビーズで標識された 単球をマウスに注入し、 ・単球のリクルートの持続性 ・病巣からのマクロファージの放出率 を評価した。 血糖値が単球の動態に与える影響が経時的にどう変化するか 血糖値がプラークからのマクロファージの遊出に影響するかを調べる 高血糖状態では、持続的に単球のリクルートが促進している。

糖尿病における単球や好中球の増加メカニズムを解明する 高血糖とアテローム性動脈硬化症の関連性を、特にプラークの退縮に着目して評価する。 プラークの 退縮 血中コレステロールの低下 糖尿病 プラークへの単球の 持続的な浸潤 1型糖尿病患者を対象として、ヒトでもマウスと同様のメカニズムが働いているかを確かめる。

糖尿病における単球や好中球の増加メカニズムを解明する 高血糖とアテローム性動脈硬化症の関連性を、特にプラークの退縮に着目して評価する。 1型糖尿病患者を対象として、ヒトでもマウスと同様のメカニズムが働いているかを確かめる。

S100A8/S100A9は1型糖尿病患者における白血球増加症と冠動脈疾患の罹患率に関わる 1986-1988年から開始されたピッツバーグ糖尿病合併症疫学研究の追跡試験を行った。 ‘50 1型糖尿病の診断 ‘80 ‘86 ‘88 調査開始 隔年で追跡試験 2004 2006 ヒトでもS100A8/A9が冠動脈疾患や白血球増加症に関わるのか？ ヒトでも総白血球数や好中球数はS100A8/A9濃度や冠動脈疾患の発症に関わっている。

S100A8/S100A9は1型糖尿病患者における白血球増加症と冠動脈疾患の罹患率に関わる ヒトの臍帯血から単離した造血前駆細胞 (CD34+ cells)をEdU (10 μM)とS100A8/A9を 含むHG(25 mM)培地で16時間培養し、(D) 細胞増殖、(E)単球の数を測定した。 ヒトでもS100A8/A9が骨髄造血の促進に関わるかを調べる。 S100A8/A9はヒト由来の造血幹細胞、単球の増加を促進した。

糖尿病における単球や好中球の増加メカニズムを解明する 高血糖とアテローム性動脈硬化症の関連性を、特にプラークの退縮に着目して評価する。 1型糖尿病患者を対象として、ヒトでもマウスと同様のメカニズムが働いているかを確かめる。 →ヒトでもマウスと同様のメカニズムが働いていることが示唆された。

S100A8/A9-RAGE経路が動脈硬化治療の新たなターゲットとなり得る。 まとめ 高血糖が白血球増加症に与える影響について以下のメカニズムが示された。 ヒトでも同様のメカニズムが働いていることが示唆された。 S100A8/A9-RAGE経路が動脈硬化治療の新たなターゲットとなり得る。

血球のマーカーについて (Becton, Dickinson and Company CD marker handbook より)