Targeting of Receptor for Advanced Glycation End Products Suppresses Cyst Growth in Polycystic Kidney Disease The Journal of Biological Chemistry, 2014, March RAGEを標的とすることは多発性嚢胞腎における嚢胞の増殖を抑制する 2015/06/01 M2　瀧井靖歩

多発性嚢胞腎とは 両側の腎臓に多数の嚢胞が形成される遺伝性の病気。 常染色体優性遺伝によって発症する。 腎機能が低下するだけでなく、高血圧などの合併症の原因にもなる。 正常な腎臓 多発性嚢胞腎 一般財団法人　全国社会保険共済会HPより

多発性嚢胞腎の発症メカニズム Ca2+ PC1 PC2 cAMP AMP ATP PDE ADC CaM PKA 細胞増殖 ERK 尿細管径の調節に関わる PC(Polycystin)-1,2をコード する遺伝子、PKD1、PKD2 の異常により正常な尿細管 が形成されず嚢胞を生じる。 尿細管上皮細胞 CaM : Calumodulin ADC : Adenylate Cyclase PDE : Phosphodiesterase cAMP AMP ATP PDE ADC CaM PKA 細胞増殖 ERK ADPKD.JPより

RAGEについて RAGE RAGE ligand ＋ AGEs の受容体として発見された、膜貫通型レセプター。 リガンド結合により、炎症やアポトーシスなど様々な反応を誘導する。 RAGE ligand AGEs (Advanced Glycation End Products) 還元糖とタンパク質などのアミノ基の反応により生成する。 ex. CML (CML (Nε-carboxy(methyl)lysine) non-AGEs ligand 内因性のタンパク質や核酸などで、RAGEのリガンドとして作用するもの。 ex. HMGB-1 (High Mobility Group Box 1) 、S100ファミリータンパク質 還元糖 タンパク質 ＋ AGEs CML HMGB-1　TLR2も受容する

背景と目的 新たに作成した多発性嚢胞腎モデルマウスにおいて、RAGEノックダウンにより 多発性嚢胞腎が改善されるかを検証した。 多発性嚢胞腎モデルマウスの腎臓において、RAGEとRAGEリガンドであるs100ファミリー タンパク質発現が増加する。 （Am J Nephrol, 2010) 多発性嚢胞腎モデルマウス由来の線維芽細胞において、s100ファミリータンパク質刺激に よるp-ERKの増加が、RAGEノックダウンで抑制される。 （Am J Nephrol, 2010) 3次元培養したMDCK細胞による嚢胞形成が、RAGEノックダウンにより抑制される。 （Am J Nephrol, 2010) pkd2（-/-）マウスにヒトPKD2遺伝子を導入することで、胎生致死性が改善する。 （Journal of Biological Chemistry, 2009) 犬腎臓由来細胞株 新たに作成した多発性嚢胞腎モデルマウスにおいて、RAGEノックダウンにより 多発性嚢胞腎が改善されるかを検証した。

shRNA導入によるRAGE遺伝子発現の阻害 shRNA導入によるRAGEノックダウンが確認された。 RAGEに対するshRNAをアデノウイルスベクターを用いてWT9-12細胞に導入し、RAGE発現量を評価した。 ※WT9-12細胞 ： 多発性嚢胞腎患者の腎臓上皮細胞由来の細胞株 shRNA導入によるRAGEノックダウンが確認された。

RAGEノックダウンが細胞増殖に与える影響 RAGEノックダウンにより、細胞増殖が抑制された。 shRNA導入72時間後、 (C) XTT assay により、細胞生存率を評価。 (D) トリパンブルー染色により、総細胞数を測定。 RAGEノックダウンにより、細胞増殖が抑制された。

PC2Rマウスにおいて多発性嚢胞腎の発症が確認された。 多発性嚢胞腎モデルマウスの作成 マウスpkd2遺伝子(+/-)のマウスと ヒトPKD2遺伝子トランスジェニックマウスを交配し、 pkd2(-/-)かつPKD2(+)のPC2Rマウスを作成 PC2Rマウスにおいて多発性嚢胞腎の発症が確認された。

PC2RマウスにおけるRAGEノックダウン PC2Rマウスを用いて、6、8、10日齢で尾静脈からanti-RAGE　アデノウイルスを導入。 その後、12、15、17日齢で腎臓におけるRAGEタンパク発現を評価。 PC2Rマウスにおいて、anti-RAGEアデノウイルス導入によるRAGEノックダウンが確認された。

PC2RマウスにおけるRAGEノックダウン anti-RAGE アデノウイルス導入による、腎臓でのRAGEノックダウンが確認された。 anti-RAGEアデノウイルス導入後、15日齢PC2Rマウスの腎臓における(C) RAGE mRNAおよび(D) タンパク質発現を評価した。 anti-RAGE アデノウイルス導入による、腎臓でのRAGEノックダウンが確認された。

RAGEノックダウンによる嚢胞形成の抑制 RAGEノックダウンにより、嚢胞形成の抑制および腎機能の回復が確認された。 PC2Rマウスにおいて、 腎臓組織切片の観察 (B) 体重・腎臓重量の測定 (C) 腎機能マーカーの定量 を行った。 BUN : Blood Urea Nitrogen RAGEノックダウンにより、嚢胞形成の抑制および腎機能の回復が確認された。

RAGEノックダウンによる部位別嚢胞形成の抑制 RAGEノックダウンにより、全ての部位で嚢胞形成が抑制された。 PC2Rマウスの腎臓組織を、 集合管マーカータンパク（DBA） 近位尿細管マーカータンパク（LTA） 遠位尿細管マーカータンパク（THP） に対する抗体を用いて免疫染色した。 RAGEノックダウンにより、全ての部位で嚢胞形成が抑制された。

RAGEノックダウンによる細胞増殖の抑制 RAGEノックダウンにより、嚢胞における細胞増殖が抑制された。 PC2Rマウスの腎臓組織を、PCNA (Proliferating cell nuclear antigen)抗体を用いて免疫染色した。 RAGEノックダウンにより、嚢胞における細胞増殖が抑制された。

RAGEノックダウンによる細胞増殖の抑制 RAGEノックダウンにより、炎症・増殖に関するシグナル伝達が抑制された。 (C) p-ERK抗体で免疫染色した。 (D) RAGEのシグナル伝達経路に 関連するタンパク質の 　　 発現およびリン酸化を評価した。 PC2Rマウスの腎臓組織を、 NFKB　p65サブユニットのいくつかのセリン残基はリン酸化されることでNFKBの活性を調節していることが知られている。 RAGEノックダウンにより、炎症・増殖に関するシグナル伝達が抑制された。

RAGEは多発性嚢胞腎治療の新たなターゲットとなり得る。 まとめ 多発性嚢胞腎モデル細胞株において、RAGEノックダウンによって細胞増殖が抑制された。 多発性嚢胞腎モデルマウスPC2Rマウスにおいて、RAGEノックダウンによって 嚢胞形成の抑制 腎機能低下の抑制 嚢胞における細胞増殖・炎症関連の遺伝子発現抑制 が認められた。 RAGEは多発性嚢胞腎治療の新たなターゲットとなり得る。 今後は、soluble RAGEの投与や、endogenous soluble RAGE発現を上昇させ ることが多発性嚢胞腎に与える影響を評価する。

RAGEリガンドについて AGEs non-AGEs ligand ＋ HMGB-1 (High Mobility Group Box 1) CML 還元糖とタンパク質などのアミノ基の反応により生成する。 生体内に最も多いのはCML (Nε-carboxy(methyl)lysine) ＋ AGEs 還元糖 タンパク質 non-AGEs ligand HMGB-1 (High Mobility Group Box 1) p53やNF-κBなどの転写因子の機能発現に関わるDNA結合タンパク質。 マクロファージや壊死細胞から放出され、RAGEやTLRのリガンドとして作用する。 HMGB-1　TLR2も受容する S100ファミリータンパク質 脊椎動物に特有のタンパク質。カルシウム結合ドメインを持ち、細胞内カルシウムイオン濃度を一定に保つバッファーとして働く。 Amyloid-β アルツハイマー病の原因となるタンパク質。