タンパク質の結晶成長 - 実は結晶成長のモデル系？ - 1/39 タンパク質の結晶成長 - 実は結晶成長のモデル系？ - 徳島大学工学部化学応用工学科 鈴木良尚

目次 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 2/39 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 4. 結晶化機構のミクロな解析 （ステップ前進速度と二次元核生成頻度） 5. まとめ

結晶成長とは？ 希望の品質・サイズの結晶を得るためにその結晶の成長機構を研究する学問 相転移の非平衡統計力学の一分野 3/39 Si wafer, d = 300 mm, (100) oriented

4/39 結晶の生い立ち 核生成 成長 ……. 臨界核

5/39 過飽和度 過飽和度大→成長速度大 同じ過飽和度でも成長速度変化→速度論的要因

6/39 結晶の育ち方 らせん転位 (a) 渦巻き成長 (b) 二次元核成長

kink step 分子の結晶への取り込み過程 Diffusion Desorption Adsorption 7/39 分子の結晶への取り込み過程 Diffusion Desorption Adsorption kink s step w h Surface diffusion

目次 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 8/39 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 4. 結晶化機構のミクロな解析 （ステップ前進速度と二次元核生成頻度） 5. まとめ

モデルタンパク質 9/39 Glucose isomerase (from Streptomyces Rubiginosus) asymmetric unit tetramer

背景 10/39 *124 PDB holdings: 31306 X-ray: 27188 NMR: 4118 (27-Sep-2005) *89 *63 *19 *15 *A summary of progress in the Human Proteome Structural Genomics Pilot Project (http://proteome.bnl.gov/)

モデルタンパク質 11/39 Glucose isomerase (from Streptomyces Rubiginosus) asymmetric unit tetramer

Visuri’s work Crystal concentration / g l-1 t / min 12/39 50 150 MPa K. Visuri et al. Bio/Technology 8 (1990) 547. 30 t / min

結晶の生い立ち 13/39 核生成 成長 ……. 臨界核

目次 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 14/39 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 4. 結晶化機構のミクロな解析 （ステップ前進速度と二次元核生成頻度） 5. まとめ

試料調製 Seed crystals Crystal Suspension Starting Solution Solution for 15/39 4 ℃ incubation Seed crystals 40℃ dissolution 0.45 mmf filtration Crystal Suspension Dilution Starting Solution Solution for Solubility measurements

グルコースイソメラーゼ結晶 Space group: I222 16/39 Space group: I222 Unit cell*: a=9.388 nm, b=9.964 nm, c=10.290 nm (Z=2) *Carrell, H. L.; Glusker, J. P.; Burger, V.; Manfre, F.; Tritsch, D.; Biellmann, J.-F. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989, 86, 4440-4444.

Morphology of the glucose isomerase crystal 17/39

18/39 過飽和度 過飽和度大→成長速度大 同じ過飽和度でも成長速度変化→速度論的要因

19/39 {101} 面の成長速度過飽和度依存性 100 MPa 0.1 MPa

20/39 渦巻き成長 二次元核成長 (Birth & Spread model)

21/39 100 MPa 0.1 MPa 渦巻き成長 二次元核成長

g(101) / kT p / MPa 0.1 4.1 ± 0.3 100 1.8 ± 0.3 ステップレッジ表面エネルギーの 圧力変化 22/39 ステップレッジ表面エネルギーの 圧力変化 g(101) / kT p / MPa 0.1 4.1 ± 0.3 100 1.8 ± 0.3

目次 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 23/39 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 4. 結晶化機構のミクロな解析 （ステップ前進速度と二次元核生成頻度） 5. まとめ

単位ステップの前進速度および二次元核生成頻度の測定が必要（しかも高圧力下！） 結晶の面成長速度のみ→不確定要素あり 24/39 単位ステップの前進速度および二次元核生成頻度の測定が必要（しかも高圧力下！） レーザー共焦点微分干渉顕微鏡#で可能！ #G. Sazaki, T. Matsui, K. Tsukamoto, et. al. J. Cryst. Growth 2004, 262, 536-542.

目的 25/39 ステップ前進速度の圧力依存性 二次元核生成頻度の圧力依存性

その場観察用高圧容器 TERAMECS Co., Ltd. Max 100 MPa 26/39 50ｍｍ 50ｍｍ Φ3ｍｍ 45゜ 18.3ｍｍ Φ30ｍｍ

高圧容器内の結晶の配置 と顕微鏡の位置関係 27/39 高圧容器内の結晶の配置 と顕微鏡の位置関係 Crystal Sapphire window 7.6 mm LCM – DIM (Olympus, FV300 + IX71 + U-DICTHC ) Objective lens (Olympus, SLCPlanFl 40 X, WD = 7.6 mm, NA = 0.55 )

P = 0.1 MPa, 26.4 ℃, 5.6 mgml-1 28/39

P = 50 MPa, 26.4 ℃, 5.6 mgml-1 29/39

30/39 6.935 nm

31/39 h101 = 7.0 ± 0.7 nm

ステップ前進速度 32/39 step kink ekink w s h

33/39 ステップ前進速度の濃度依存性

二次元核生成頻度 34/39

35/39 二次元核生成頻度の圧力依存性

36/39 二次元核生成頻度の過飽和度依存性

目次 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 37/39 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 4. 結晶化機構のミクロな解析 （ステップ前進速度と二次元核生成頻度） 5. まとめ

38/39 結論 Pressure 　V(101) Pressure 　　Js(101) タンパク質結晶 →結晶成長機構を探るモデル物質

39/39 謝辞 本研究の一部は東北大学金属材料研究所研究部共同研究の一環として行われました。改めて感謝申し上げます。 メンバー 佐崎　元, 中嶋一雄 （東北大学金属材料研究所） 松本雅光, 永澤眞（テラメックス株式会社） 田村勝弘（徳島大学工学部）

6.935 nm

h101 = 7.0 ± 0.7 nm

Morphology of the glucose isomerase crystal

Growth rate of {101} face 100 MPa 0.1 MPa Ce(0.1 MPa) =2.6±0.5 mg ml-1

Dimer形成 3053.98 kJ/mol Tetramer形成 1200.42 kJ/mol Tetramer形成 972.80 kJ/mol Tetramer間 219.67 kJ/mol

Background Crystal Molecule Enzymatic activity Atmospheric pressure Unfolding (denaturation) Crystal Molecule Enzymatic activity Activity Pressure

背景 タンパク質は高圧力下で常圧下とは異なる機能を発現（αキモトリプシン、タカアミラーゼAなど） →高圧力下での分子立体構造の変化が原因？ 　→高圧力下での分子立体構造の変化が原因？ p Denatured Native T

背景 深海微生物の増殖速度などは高圧力下で最も高い →高圧力下で最も高い活性を持つタンパク質が存在 絶対高圧性細菌の生育プロファイル 　→高圧力下で最も高い活性を持つタンパク質が存在 絶対高圧性細菌の生育プロファイル （海洋科学センターDeepstar group）

以上の問題の解決のためには？ 高圧力下でのタンパク質の分子構造の原子レベルでの解明が必要 NMR（Rafaee, et al. J. Mol. Biol. 2003, 327, 857-865）　 X線結晶構造解析

モデルタンパク質 Glucose isomerase (from Streptomyces Rubiginosus, I222, a=9.388 nm b=9.968 nm c=10.290 nm) asymmetric unit tetramer

Future works 3D structure analysis of the crystal of pressurized protein (ex situ or in situ) Effects of pressure on the Enzymatic activity

Concentration distribution Growth 24.7℃, 100 MPa Dissolution 44.1℃, 100 MPa

Te TG < < TD Bulk concentration → C Growth Equilibrium Interference fringes Crystals Interference fringes Growth Equilibrium Dissolution TG < Te < TD

Solubility curves 0.1 MPa 100 MPa

Inner cell

Thermodynamic relations

van’t Hoff plot 0.1 MPa 100 MPa

Thermodynamic functions Protein (crystal form) Pressure 0.1 MPa 50 MPa 100 MPa Lysozyme (tetragonal) DH / kJ mol-1: 130±10 110±20 70±10 DS / J mol-1 K-1: 460±40 400±60 280±40 DV / cm3 mol-1: -18±46 Lysozyme (orthorhombic) DH / kJ mol-1: 35±3 35±5 DS / J mol-1 K-1: 140±10 140±20 DV / cm3 mol-1 : 5±18 Glucose isomerase DH / kJ mol-1: 160±40 210±60 DS / J mol-1 K-1: 420±100 580±180 DV / cm3 mol-1 : 54±31

Growth rate of {101} face

Growth rate and Supersaturation

Michelson interferometer High-pressure vessel Inner cell