セラミド分解の標的導入は全身の代謝を改善し、脂肪肝を減らす Targeted Induction of Ceramide Degradation Leads to Improved Systemic Metabolism and Reduced　 Hepatic Steatosis  セラミド分解の標的導入は全身の代謝を改善し、脂肪肝を減らす Jonathan Y. Xia, William L. Holland, Christine M. Kusminski, Kai Sun, Ankit X. Sharma, Mackenzie J. Pearson, Angelica J. Sifuentes, Jeffrey G. McDonald, Ruth Gordillo, Philipp E. Scherer  Cell Metabolism  Volume 22, Issue 2, Pages 266-278 (August 2015) DOI: 10.1016/j.cmet.2015.06.007

背景 セラミドとインスリン抵抗性 肝臓の脂質代謝やインスリン感受性に対するセラミド量の影響を調べるため 　セラミドとインスリン抵抗性 ・ げっ歯類において、肝臓や血漿セラミド量の増加は肝臓機能不全およびインスリン 抵抗性、脂肪蓄積を起こす (Ichi et al., 2007; Xia et al., 2014; Yetukuri et al., 2007) ・ 肥満が引き起こすインスリン抵抗性はセラミドによって誘導され、その標的は肝臓 　 である (Holland et al., 2007) ・ C16セラミドはインスリンの作用を強く阻害する (Raichur et al., 2014; Turpin et al., 2014) ・ 酸性セラミダーゼを過剰発現させたC2C12培養細胞では飽和脂肪酸によるインス リン作用の阻害を防ぐ (Chavez et al., 2003) スフィンゴイド塩基 セラミド O H H O O H N R n n N H セラミダーゼ ＋ O H O R 脂肪酸 肝臓の脂質代謝やインスリン感受性に対するセラミド量の影響を調べるため 組織特異的にセラミダーゼを過剰発現させる遺伝子を導入したマウスを用いて 脂質量やインスリンシグナル伝達を評価した。

酸性セラミダーゼを肝臓特異的に過剰発現するマウス Alb-AC Fig.S1 Tet onシステムを組み込んだ 　ドキシサイクリン（dox）存在下で目的遺伝子を発現する HFD-dox (200mg) 8週間 セラミダーゼmRNA発現量・活性 測定 Alb-AC 肝臓特異的に酸性セラミダーゼmRNA発現が増加 肝臓の酸性セラミダーゼ活性が増加 血清の酸性セラミダ ーゼ活性は変化なし

肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現によりセラミドが減少 Fig.1 HFD-dox (200mg) 8週間 セラミド測定（肝臓、血清） Alb-AC 肝臓および血清中のセラミド（C16:0、C18:0）が減少

肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 糖負荷試験 血糖値低下 血中インスリン濃度低下 Fig.1 Alb-AC グルコース経口投与（2.5g/kg体重） HFD-dox (200mg) 8週間 絶食3h 15 30 60 120 min Alb-AC 尾静脈から採血 血糖値低下 血中インスリン濃度低下

肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 インスリン抵抗性試験 インスリン投与後の 血糖値低下が亢進 Fig.1 Alb-AC インスリン腹腔内投与（0.75U/kg体重） HFD-dox (200mg) 8週間 絶食3h 10 20 30 min Alb-AC 尾静脈から採血 インスリン投与後の 血糖値低下が亢進

肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 グルコースクランプ試験 Fig.1 グルコース注入量多い Alb-AC HFD-dox (200mg) 8週間 サンプリング 尾静脈から採血 インスリン 血糖値を 一定にする グルコース （3H標識） ＋デオキシグルコース 投与量と血中検出量から組織に取り込まれたグルコース量がわかる F グルコース注入量多い ＝インスリン感受性高い 腸間膜脂肪組織、精巣周囲脂肪組織、皮下脂肪組織において2-デオキシグルコース取り込み量が増加 肝臓でのグルコース 産生率減少 （グルコース投与量と骨格筋へ の取り込まれた量から算出）

肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 インスリンシグナル伝達 Fig.1 インスリン グルコース グリコーゲン合成 酵素キナーゼ3β グリコーゲン 受容体 グルコース グリコーゲン合成 酵素キナーゼ3β GLUT2 リン酸化 グリコーゲン 合成酵素 UDPグルコース グリコーゲン 肝細胞

肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 インスリンシグナル伝達 Fig.1 Akt p-Akt 肝臓だけでなく脂肪組織のインスリン シグナル伝達が亢進 受容体 インスリン IRS2がリン酸化される PI3Kがリン酸化される Akt p-Akt グルコース グリコーゲン合成 酵素キナーゼ3β GLUT2 リン酸化 肝臓だけでなく脂肪組織のインスリン シグナル伝達が亢進 グリコーゲン 合成酵素 UDPグルコース グリコーゲン 肝細胞

肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 肝臓脂質蓄積 Fig.２ 肝臓サンプリング 肝臓重量減少 (Fig. 1) 肝臓中の トリグリセリド 減少 HFD-dox (200mg) 8週間 Fig.２ 肝臓サンプリング 肝臓組織のHE染色（細胞核、細胞質を染色） Alb-AC 肝臓重量減少 (Fig. 1) 肝臓中の トリグリセリド 減少 ジアシルグリセロール＋アシルCoA 　　　　　　　　→トリグリセリド

脂質エマルション単回投与（15μL/g体重） 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 トリグリセリドクリアランス試験 Fig.２ 脂質エマルション単回投与（15μL/g体重） HFD-dox (200mg) 8週間 一晩絶食 1 2 3 4 5 6 7 h Alb-AC 尾静脈から採血 血中にトリグリセリドが多く存在 血中に放出されたVLDLが増加 阻害剤 VLDL LDL リポたんぱく質リパーゼ TG

肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 脂質取り込み評価 Fig.２ 肝臓への脂質の取り込みが減少、脂肪組織へは増加 Alb-AC 3H-トリオレイン（2μCi, 100μL/匹）尾静脈注射 HFD-dox (200mg) 8週間 20 min 放射活性測定 Alb-AC 5時間絶食 肝臓への脂質の取り込みが減少、脂肪組織へは増加

炎症性サイトカインのmRNA発現量が低下 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 精巣周囲脂肪組織（炎症） Fig.２ HFD-dox (200mg) 8週間 サンプリング Alb-AC 王冠様構造 脂肪の過剰蓄積により肥大化し細胞死をおこしたものをマクロファージが取り囲んでいる構造 免疫担当細胞が貪食・処理をすることで、慢性炎症が生じている S2 王冠様構造が減少 （マクロファージを免疫染色） 炎症性サイトカインのmRNA発現量が低下 マクロファージが減少

肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 精巣周囲脂肪組織（線維化） F S2 Fig.２ サンプリング WT Alb-AC HFD-dox (200mg) 8週間 サンプリング Alb-AC 肝線維症は肝障害の徴候 肝臓における結合組織の蓄積であり、肝細胞損傷に対する反応である 基質コラーゲン代謝の調節を異常とし、異常な基質を過剰に生産する F S2 WT Alb-AC 線維化の程度が減弱 線維化マーカーのmRNA発現量が低下

肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 精巣周囲脂肪組織（セラミド） Fig.２ サンプリング ラクトシルセラミドなどが減少 スフィンゴシンなどが減少 HFD-dox (200mg) 8週間 サンプリング O H N R n Alb-AC スフィンゴイド塩基 極性基 ラクトシルセラミドなどが減少 スフィンゴシンなどが減少

肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 小括 セラミド セラミド セラミド グルコース取り込み ジアシルグリセロール グルコース 脂質取り込み トリグリセリド VLDL 炎症、線維化 インスリンシグナル インスリン感受性 インスリンシグナル

酸性セラミダーゼを脂肪組織特異的に過剰発現するマウス Art-AC Fig.S3 Tet onシステムを組み込んだ 　ドキシサイクリン（dox）存在下で目的遺伝子を発現する HFD-dox (200mg) 10日間 セラミダーゼmRNA発現量・活性 測定 Art-AC 白色脂肪組織に酸性セラミダーゼmRNA発現が増加 白色脂肪組織の酸性セラミダーゼ活性が増加 血清の酸性セラミダ ーゼ活性は変化なし

脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現によりセラミド減少 Fig.3 HFD-dox (200mg) 10日間 セラミド測定（脂肪組織、血清） Art-AC 脂肪組織および血清中のセラミドが減少 血清中のスフィンゴイド塩基が増加

脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 糖負荷試験 血糖値低下 血中インスリン濃度低下 Fig.3 Art-AC グルコース経口投与（2.5g/kg体重） HFD-dox (200mg) 10日間 絶食3h 15 30 60 120 min Art-AC 尾静脈から採血 糖投与15分後 血糖値低下 血中インスリン濃度低下

脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 インスリン抵抗性試験 インスリン投与後の 血糖値低下が亢進 Fig.3 Art-AC インスリン腹腔内投与（0.75U/kg体重） HFD-dox (200mg) 10日間 絶食3h 10 20 30 min Art-AC 尾静脈から採血 インスリン投与後の 血糖値低下が亢進

脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 グルコースクランプ試験 Fig.3 グルコース注入量多い Art-AC HFD-dox (200mg) 10日間 サンプリング 尾静脈から採血 インスリン 血糖値を 一定にする グルコース （3H標識） ＋デオキシグルコース 投与量と血中検出量から組織に取り込まれたグルコース量がわかる グルコース注入量多い ＝インスリン感受性高い 腸間膜脂肪組織、精巣周囲脂肪組織、皮下脂肪組織において2-デオキシグルコース取り込み量が増加 肝臓でのグルコース 産生率減少 （グルコース投与量と骨格筋へ の取り込まれた量から算出）

脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 インスリンシグナル伝達 Fig.3 Akt p-Akt 脂肪組織と肝臓の インスリンシグナル伝達が亢進 受容体 インスリン IRS2がリン酸化される PI3Kがリン酸化される Akt p-Akt グルコース グリコーゲン合成 酵素キナーゼ3β GLUT2 リン酸化 グリコーゲン 合成酵素 UDPグルコース グリコーゲン 脂肪組織と肝臓の インスリンシグナル伝達が亢進 肝細胞

脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 精巣周囲脂肪組織 Fig.4 S4 サンプリング 王冠様構造 王冠様構造が減少 マクロファージが減少 HFD-dox (200mg) 10日間 S4 サンプリング Art-AC 炎症性サイトカイン 線維化マーカー mRNA発現量が低下 王冠様構造 王冠様構造が減少 マクロファージが減少 線維化抑制

脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 肝臓脂質蓄積 Fig.4 サンプリング 肝臓中の トリグリセリド 減少 HFD-dox (200mg) 10日間 肝臓組織のHE染色（細胞核、細胞質を染色） サンプリング Art-AC 肝臓中の トリグリセリド 減少

脂質エマルション単回投与（15μL/g体重） 脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 TGクリアランス試験 Fig.4 脂質エマルション単回投与（15μL/g体重） HFD-dox (200mg) 10日間 一晩絶食 1 2 3 4 5 6 h Art-AC 尾静脈から採血 血中トリグリセリド量に変化なし 血中に放出されたVLDLに変化なし 阻害剤 VLDL LDL リポたんぱく質リパーゼ TG

3H-トリオレイン（2μCi, 100μL/匹）尾静脈注射 脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 脂質取り込み評価 Fig.4 3H-トリオレイン（2μCi, 100μL/匹）尾静脈注射 HFD-dox (200mg) 10日間 20 min 放射活性測定 Art-AC 5時間絶食 肝臓への脂質の取り込みが減少

脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 小括 セラミド セラミド セラミド スフィンゴイド塩基 グルコース取り込み トリグリセリド グルコース 脂質取り込み VLDL 炎症、線維化 インスリンシグナル インスリン感受性 インスリンシグナル

脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現させた方が早く 脂肪肝誘導後に酸性セラミダーゼ過剰発現 肝臓中セラミド量 Fig.5 HFD 2ヵ月間 HFD-dox (200mg) 肝臓にセラミダーゼ過剰発現 Alb-AC 脂肪肝誘導 2 4 8 週 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現 Art-AC 3 14 28 日 酸性セラミダーゼ過剰発現 酸性セラミダーゼ過剰発現 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現させた方が早く 肝臓中のセラミド量を低下

脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現させた方が早く 脂肪肝誘導後に酸性セラミダーゼ過剰発現 インスリンシグナル伝達 Fig.5 HFD 2ヵ月間 HFD-dox (200mg) 肝臓にセラミダーゼ過剰発現 Alb-AC 脂肪肝誘導 2 4 8 週 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現 Art-AC 3 酸性セラミダーゼ過剰発現 酸性セラミダーゼ過剰発現 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現させた方が早く インスリンシグナル伝達が亢進

脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現させた方が早く 脂肪肝誘導後に酸性セラミダーゼ過剰発現 肝臓脂質蓄積 Fig.5 HFD 2ヵ月間 HFD-dox (200mg) 肝臓にセラミダーゼ過剰発現 Alb-AC 脂肪肝誘導 3 14 30 60 日 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現 Art-AC 3 14 28 日 酸性セラミダーゼ過剰発現 酸性セラミダーゼ過剰発現 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現させた方が早く 肝臓トリグリセリド蓄積量減少

脂肪組織セラミダーゼ過剰発現の方が早く脂肪肝やインスリン感受性に効果を及ぼした 脂肪肝誘導後に酸性セラミダーゼ過剰発現 インスリン抵抗性試験 Fig.5 HFD 2ヵ月間 HFD-dox (200mg) 肝臓にセラミダーゼ過剰発現 Alb-AC 脂肪肝誘導 3 日 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現 Art-AC 3 日 酸性セラミダーゼ過剰発現 酸性セラミダーゼ過剰発現 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現誘導３日目でインスリン感受性改善 脂肪組織セラミダーゼ過剰発現の方が早く脂肪肝やインスリン感受性に効果を及ぼした

セラミダーゼ過剰発現により、肝臓のCD36発現量が低下 Fig.6 CD36：細胞内への脂肪酸輸送促進 HFD-dox (200mg) 2ヵ月間 Alb-AC 肝臓にセラミダーゼ過剰発現 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現 Art-AC セラミダーゼ過剰発現により、肝臓のCD36発現量が低下

セラミドによるCD36の膜移行はPKCζを介す Fig.6 ・ 心筋細胞においてPKCζはCD36の活性化を促進し、脂質の取り込みを促進する(Luiken et al., 2009) ・ セラミドはPKCζの活性因子である(Muller et al., 1995) C2セラミド100μM（or DMSO） 氷冷PBSで洗う（3回） 回収 60分 CD36免疫染色 H4iie（ラット肝がん由来細胞） 90～100%コンフルエント ドミナントネガティブ (不活性) 常時活性型 DAPI（細胞核を染色） CD36が膜移行 CD36は膜に局在していない セラミド添加前からCD36が膜局在 セラミドによるCD36の膜移行はPKCζを介す

酸性セラミダーゼ過剰発現とPKCζ Fig.6 セラミダーゼ過剰発現により肝臓のPKCζ発現量が減少し、活性は低下する HFD-dox (200mg) 8週間 Alb-AC 肝臓にセラミダーゼ過剰発現 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現 セラミダーゼ過剰発現により肝臓のPKCζ発現量が減少し、活性は低下する

セラミドとPKCζ活性、脂肪酸取り込み Fig.6 セラミド添加によって脂肪酸取り込み促進 セラミド添加によってPKCζ活性化 0.2%BSA (脂肪酸不含) +PKCζ偽基質阻害剤 C2セラミド100μM 氷冷PBSで洗う（3回） 回収 90分 60分 H4iie（ラット肝がん由来細胞） 90～100%コンフルエント dn：ドミナントネガティブ（不活性） Ca：常時活性 セラミド添加によって脂肪酸取り込み促進 セラミド添加によってPKCζ活性化

スフィンゴシンとPKCζ活性、脂肪酸取り込み Fig.S5 0.2%BSA (脂肪酸不含) +PKCζ偽基質阻害剤 スフィンゴシン50μM 氷冷PBSで洗う（3回） 回収 90分 60分 H4iie（ラット肝がん由来細胞） 90～100%コンフルエント スフィンゴシンは、セラミダーゼ反応の生成物であり、複数のPKCの阻害剤 スフィンゴシンはPKCζの活性を抑制 スフィンゴシンはセラミドによる 脂肪酸取り込みを抑制

PKCζ阻害剤はセラミダーゼ過剰発現時と同じくらい インスリン抵抗性試験 Fig.6 インスリン腹腔内投与（0.75U/kg体重） HFD-dox (200mg) ＋APCD（PKCζ阻害剤） Alb-AC 2ヵ月間 絶食3h 10 20 30 min Art-AC 尾静脈から採血 酸性セラミダーゼ過剰発現 酸性セラミダーゼ過剰発現 PKCζ阻害剤はセラミダーゼ過剰発現時と同じくらい インスリン感受性を改善

PKCζ阻害剤はセラミダーゼ過剰発現時と同じくらい Fig.6 HFD-dox (200mg) ＋APCD（PKCζ阻害剤） Alb-AC サンプリング 2ヵ月間 Art-AC PKCζ阻害剤はセラミダーゼ過剰発現時と同じくらい 肝臓中トリグリセリド量を低下

総括 ・ セラミドはPKCζの活性化を促進し、CD36による脂肪酸の取り込みを増加させた 肝臓のセラミダーゼ過剰発現 肝臓 脂肪組織 セラミド 脂質 取り込み インスリンシグナル伝達 インスリン感受性改善 互いのスフィンゴ脂質量がインスリン感受性や肝臓脂肪蓄積に影響 脂肪組織のセラミダーゼ過剰発現 肝臓 脂肪組織 セラミド 脂質 取り込み インスリンシグナル伝達 インスリン感受性改善 ・ セラミドはPKCζの活性化を促進し、CD36による脂肪酸の取り込みを増加させた ・ 脂肪組織でのセラミダーゼ過剰発現による脂肪肝抑制やインスリン感受性改善は 　 肝臓でのセラミダーゼ過剰発現よりも早く効果を示した