タンパク3000プロジェクト個別的解析プログラム 代謝系グループ 平成14年度 成果報告 大阪大学大学院理学研究科 代表：倉光成紀 副代表：増井良治
特殊環境微生物由来のタンパク質 代謝系グループ ターゲット ● 極限環境微生物 代謝系グループ ターゲット 特殊環境微生物由来のタンパク質 ● 極限環境微生物 好熱性古細菌 Sulfolobus tokodaii（好気性，好酸性） Aeropyrum pernix（好気性），など 好冷菌（低温菌） Acinetobacter, Alteromonas, Flavobacterium ● 病原性微生物 ● その他 S. tokodaii A. pernix
タンパク3000「代謝系グループ」平成14年度連絡会 日 時 平成15年 1月 6日(月)1:00〜6:30 pm 場 所 大阪大学 豊中キャンパス 基礎工学部国際棟（Σホール） ディスプレイ室
代謝系グループ参加者（平成14年度）
構造解析／機能解析の終了したタンパク質（平成14年度）
平成14年度PDB公開済タンパク質 1LWB 1GIQ 1IWP 1KOL 1N7K 1L2L 1IZE 1UAZ
代謝系グループ 実施内容 ゲノム解析 （現 製品評価技術基盤機構による全塩基配列決定） 代謝系グループ 実施内容 ゲノム解析 （現 製品評価技術基盤機構による全塩基配列決定） ターゲットの選択： 新規ファミリー蛋白質，有用・重要蛋白質 タンパク質の調製： プラスミド作製，発現スクリーニング 大量発現，精製 立体構造解析： Ｘ線結晶構造解析，NMR による構造解析 機能解析： 反応速度論的解析，他 バイオインフォマティクスによる 蛋白質の構造・機能の体系化， 産業利用
発現用プラスミドの構築 pET-11a PCR, TA cloning ligation coding region BamHI BamHI ATATCATATG----- ------TAATAAGGATCCATAT ATATCATATG----- ------TAATAAGGATCCATAT coding region PCR, TA cloning ligation pET-11a BamHI BamHI
発現用プラスミドの大量調製 形質転換体をチューブで直接培養し，プラスミド自動分離装置で調製する。
発現チェックの例 pET-11a Rosetta-gami(DE3) IPTG 誘導なし 熱処理沈殿 熱処理上清 破砕液沈殿 破砕液上清
高密度培養装置 ・温度，攪拌，pH，消泡，濁度，DO， 排気CO2，排気O2 を測定・制御 ・栄養源・発現誘導物質の自動添加 ・培養液のオートサンプリング
高密度培養の例 pH ExCO2 DO OD あるORFの pET-11a で BL21(DE3) を形質転換 ↓ 形質転換体のコロニーを ↓ 形質転換体のコロニーを 培地 3 L に直接植菌 pH 7.2, 37℃, 800 rpm で培養 グリセロールを追加 （IPTG誘導なし） 集菌 → 約100 g の菌体を回収 pH ExCO2 DO OD
タンパク質精製用システム