発光絶対光量測定法の開発と 生物発光の量子収率測定 発光絶対光量測定法の開発と 生物発光の量子収率測定 安東頼子A,B、山田展之C 入江勉C、榎本敏照C 久保田英博B,C、秋山英文A,B 東大物性研A、科技機構B、アトーC

ホタル “King of Flash Light !” 量子収率は “88％ !!” とされてきた。 しかし、 絶対値発光量測定の必要性 ●発光マーカーを用いた定量計測 　発光標識技術を用いた生体反応等の定量測定 ●発光新材料開発　 　　生体分子や半導体ナノ材料等の発光新材料　　開発時にその発光効率を定量的に知りたい 今回の研究目的 ホタル　“King of Flash Light !” 量子収率は　“88％ !!”　とされてきた。　　　　　　　　　　　　　しかし、 疑問： 1959年当時の検出器の精度や、 　　　サンプルの純度はどうだったのだろう？ 追試しよう！

生物発光の量子収率測定 生物発光の量子収率文献値 発光基質に対し、大過剰のトリガーと十分に反応に与る環境 発光が終わるまで測定する 　 ホタル 　　　　　 88％　（ 40 years ago…） クラゲ（イクオリン） 23% （ 30 years ago…） ※ただし両方とも天然もの 発光基質に対し、大過剰のトリガーと十分に反応に与る環境 発光が終わるまで測定する 　ホタル　　5～100分 　 　クラゲ 数秒

ホタルルシフェリンの発光過程 発光 ルシフェリン＋ＡＴＰ-------------------- 　ルシフェリン＋ＡＴＰ-------------------- 　　　ルシフェリン-ＡＭＰ-ルシフェラーゼ　+　Ｐ-Ｐ ルシフェリン-ＡＭＰ-ルシフェラーゼ------------ 　　　　生成物-ルシフェラーゼ　+　　 Ｍｇ2+，ルシフェラーゼ Ｏ２ 発光 遺伝子発現検出系 --レポーターアッセイ ＡＴＰ量測定系　　 --ATPの定量 　微生物の定量 　細胞の定量　　　　 ＜標準な組み合わせとする＞　濃度（Ｍ）　液量（μｌ） ①ルシフェリン　　　　　　　 　 1.65×10-7 　 5 ②ルシフェラーゼ (和光) 　 2×10-5 　 　 5 ③Mg2+ 　 0.1 　　 　5 ④グリシルグリシン(pH7.6) 　 0.25 　　　100 ⑤ATP 　　　 1×10-3 　　　　　5 ※遺伝子組換え体ルシフェラーゼ

イクオリンの発光過程 Ｃａ2+ イクオリン--------- 発光 アポイクオリン + セレンテラミド + ＣＯ2 + 　イクオリン--------- アポイクオリン + セレンテラミド + ＣＯ2 + 　 Ｃａ2+ 発光 (図：下村脩,バイオサイエンス最前線vol.22,1998) カルシウムの動的イメージプローブ 　　　⇒細胞内生体機能の解析 　　　⇒環境汚染物質の検出 　　　　　　　　　　　　　　　　濃度（Ｍ）　液量（μｌ） ①　イクオリン (チッソ) 　　4.5e-9　　　　5～20　 ②　Ca(NO3)2 　　　　　　　　0.1　 　　100～110 ※遺伝子組換え体イクオリン

測定法 ●測定系の反射・透過率 絶対値発光量測定系 ●レンズの立体角 η＝3.4％ （∵ＮＡ=0.26） total 1.0％ 分光器 冷却 ＣＣＤ ＰＣ PS白色セル（3.5×3.5×11mm3） full 120μｌ lens(f=50,43Φ) mirror ←発光基質溶液 ↑ Long cut filter 80mm 133mm トリガー溶液 絶対値発光量測定系 ●レンズの立体角　 η=1/2{1-(1-sin2θ)1/2} =1/2{1-(1-NA2)1/2}　　 白色セルを用いており、溶液からの発光 がほぼ100％セルの外に出てくるとする η＝3.4％ （∵ＮＡ=0.26） 　　　　　total 　1.0％ ●測定系の反射・透過率 　　ミラー ×1枚, 　レンズ ×1枚 　　long cut filter ×1枚 　　分光器内　 　　　　ミラー×3枚+グレーティング1枚 　　or　ミラー×4枚 　　　透過率　30.1％ 　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　 ●分光器及び冷却ＣＣＤの感度校正 波長感度校正 with 白色ランプ 量子効率+プリアンプのゲインとＡＤ変換換算値 with He-Neレーザー 7.3（photon/count）

ホタルルシフェリンの発光測定 発光スペクトル ｐＨ7.6 Photon数 8.41×1011 分子数 3.24×1012 ＰＬ 発光スペクトル Photon数　8.41×1011 分子数　　　 3.24×1012 量子収率　　24.5％ ｐＨ7.6 Peak at 570(nm) ⊿t=60(min)

イクオリンの発光測定 発光スペクトル Photon数 1.45×109 分子数 1.34×1010 量子収率 10.86％ 分子数　　 　1.34×1010 量子収率　　10.86％ Peak at 470(nm) ⊿t=30(sec) とＥＤＴＡ

測定精度の見積もり 確率誤差 （％） 系統誤差 ワーストケース… ±50％ Ｃount数（ショットノイズ） <<±1 確率誤差　　　　　　　　　（％） Ｃount数（ショットノイズ）　 <<±1　 　立体角　　　　　　　　　　　 　 ±4.7 分子数　　　　　　　　　　　 ±6 +)________________________ 　±7.6 系統誤差 ＣＣＤ感度校正 　　　　　　 ±8 光学系反射・透過率 ±2 白色セルの校正　　　　　 ±40 ワーストケース…　　±50％

考察 ホタルルシフェリン 量子収率 21.1 ± 3.5 （％） イクオリン 量子収率 9.1 ± 1.6 （％） 　考察 ホタルルシフェリン 　 量子収率　21.1 ± 3.5 （％） イクオリン 　 量子収率　 9.1　± 1.6 （％） ホタルの量子収率が８８％に なるには、測定結果に約４倍の 誤差が生じなければならない・・・ 　ワーストケース．．．で 見積もっても、3,40％を超える 事は無いのでは？ サンプルが天然ものか 遺伝子組換えものである という違いは？ ●ホタルに関して天然ものの方が 　量子収率が高いという感じは無い（要追試） ●イクオリンの方は精製品の方が安定で 　高純度だとうたっている

まとめと今後 ホタルとクラゲの発光量子収率を求めた。 　両者共に、文献値よりも小さい値となっ　　たが、我々の測定誤差を考慮した範囲で　も、それぞれ８８％、23％という値は高い　感じがしている。 本測定系では特に白色セルに関しての 　工夫と校正を確立する事により、より 　正確な絶対値発光量測定が可能になる。

ホタルルシフェリンの発光測定 発光スペクトル 発光時間測定 Photon数 8.41×1011 分子数 3.24×1012 ＰＬ 発光スペクトル Peak at 570(nm) ⊿t=60(min) Photon数　8.41×1011 分子数　　　 3.24×1012 量子収率　　25.9％ ＡＴＰ濃度（Ｍ）　量子収率（％） 　　1×10-2　　　　　20.0 1×10-3　　　　　23.2 発光時間測定