大腸菌 における HSP ６０ のペリプラズムま たは菌体表層局在について. Ｓｐｉｒｏｓｏｍｅはペリプラズムにある と想定して ｓｐｉｒｏｓｏｍｅ がペリプラズムから分離で きるか否かを調べる。 細胞壁溶解直後の菌体を電子顕微鏡で観察する。 安定型 Ｌ－ｆｏｒｍ (EcL 株） の ｓｐｉｒｏｓ.

Presentation on theme: "大腸菌 における HSP ６０ のペリプラズムま たは菌体表層局在について. Ｓｐｉｒｏｓｏｍｅはペリプラズムにある と想定して ｓｐｉｒｏｓｏｍｅ がペリプラズムから分離で きるか否かを調べる。 細胞壁溶解直後の菌体を電子顕微鏡で観察する。 安定型 Ｌ－ｆｏｒｍ (EcL 株） の ｓｐｉｒｏｓ."— Presentation transcript:

1 大腸菌 における HSP ６０ のペリプラズムま たは菌体表層局在について

2 Ｓｐｉｒｏｓｏｍｅはペリプラズムにある と想定して ｓｐｉｒｏｓｏｍｅ がペリプラズムから分離で きるか否かを調べる。 細胞壁溶解直後の菌体を電子顕微鏡で観察する。 安定型 Ｌ－ｆｏｒｍ (EcL 株） の ｓｐｉｒｏｓ ｏｍｅ を調べる。 実験 １ 実験 ２ 実験３

3 リゾチーム液で処理した菌体を ３％ NaCl 液に懸濁し、攪拌 処理によりペリプラズム蛋白を外液に遊離させる 細胞膜を壊さずペリプラズムの 蛋白 を分離することを試 みた Spirosome の局在を調べる目的で 細胞質内 細胞壁 ペリプラズム 細胞膜

4 リゾチームで作成し たスフェロプラスト ③攪拌 後上清 ②攪拌 後ス フェロ プラス ト 更に１０００ ０回転３０分 遠心 ３０００回 転 １５分遠心 NaCl ２％以上の溶液中で攪拌しても スフェロプラストはほとんど壊れない ①攪拌前ス フェロプラ スト NaCl 溶液中 で 30 秒間攪拌

5 １ 撹拌前のスフェロプラスト 菌体 ２ 撹拌後のスフェロプラスト 菌体 ３ 攪拌後の上清 矢印 spirosome 蛋白 スフェロプラストを 3 ％ NaCl 溶液中で撹拌した場合の spirosome 蛋白 結 果 攪拌によってｓｐｉｒ ｏｓｏｍｅがペリプラ ズムから遊離したと考 えられる kDa 94 67 43 30 １ ２ ３ - - -

6 １． 撹拌前のスフェロプラスト 菌体 ２． 撹拌後のスフェロプラスト 菌体 ３． 上清成分。 大腸菌スフェロプラストを 1.75 ％ NaCl 液に懸濁し、攪 拌した前後の蛋白の比較 94- 67- 43- 30- １２３ kDa Spirosome 60kDa

7 12 94 67 43 30 E.coli B 30 ℃と 45 ℃培養（ PYG 培地 静置培養）による 60kDa 蛋白の発現 1 30 ℃ 培養 2 45 ℃ 培養 矢印 60kDa 蛋白 結果 60kDa 蛋白 は、 30 ℃培養に 比較して 45 ℃培養で著し く増加した

8 A, １． 撹拌前のスフェロプラスト菌体 ２． 撹拌後のスフェロプラ スト菌体 ３． 上清成分。 B, 攪拌後の上清成分（ A, ３）のウエスタンブロッティング。 矢印 60kDa 蛋白 大腸菌スフェロプラストを 1.75 ％ NaCl 液に懸濁し、攪 拌した前後の蛋白の比較と、 60 ｋ Da 蛋白の抗 HSP60 モノ クローナル抗体によるウエスタンブロッティング 94 67 43 kDa ３ B 94- 67- 43- 30- １２３ kDa A

9 １ E.coli B （全菌 体） ２ E.coli L-form （全 菌体） 矢印 spirosome 蛋白 35 ℃ 培養の L-form EcL 株には spirosome 蛋白と同様に 60 kDa に相当するバンドが なかった 安定型 Ｌ－ｆｏｒｍ株の６０ kDa 蛋白を調べた (35 ℃､ 8 時間培養） E.coli の安定型 L-form （Ｅ ｃＬ株） １ ２ 94- 67- 43- 30- kDa 矢印 60 kDa 蛋白

10 kDa 123 94 43 30 67 A A, SDS-PAGE １． 野生株全菌体 ２． 安定型 L-form 株全菌体 ３． 培養上清 B, 抗 HSP60 モノクローナル 抗体によるウエスタンブロッ ティング。 １． 野生株 ２． 安定型 L-form 株 ３． 培養上清 矢印 60kDa 蛋白 大腸菌の 安定型 L-form 株と野生株における HSP60 の比較 (45 ℃､ 8 時間培養） 123 94 67 43 30 B 45 ℃培養の 安定型 L-form 株にも６０ kDa 蛋白のバンドは 見られなかった

11 12345 1 E.coli B 株 37 ℃ 培養 全菌体 2 E.coli B 株 45 ℃ 培養 全菌体 3 E.coli L-form 株 37 ℃培養 全菌体 4 E.coli L-form 株 45 ℃培養 全菌体 5 E.coli L-form 株 45 ℃培養の培地 E.coli の野生株と安定型 L-form 株における HSP60 の発現 L-form 株は 45 ℃で増殖できる。しかし HSP60 は発現していない。 67- kDa ポンソー S 染 色 ウエスタンブロッティング

12 矢印は HSP60 像、スケールは 100 ｎｍ 大腸菌スフェロプラストを 1.75 ％ NaCl 液に懸濁攪拌し、 1 万回転 30 分遠心で菌体を除いた上清を 4 万回転､ 2 時間の 遠心分離で得た沈査の電子顕微鏡像

13 本法で精製（分別遠心）した HSP60 の電子顕微鏡 像（ネガティブ染色） Viitnen P.V,et.al. 1992 J.B.C.

14 ま と め １．大腸菌 のスフェロプラストを１．７ ５％ NaCl 液中で攪拌すると 60KDa 蛋白は 細胞分画より外液の方により多く見られ た。 また安定型 L － form 株ではこの蛋白が検出されなかっ た。 ２．この 60KDa 蛋白は抗 HSP ６０モノク ローナル抗体によって HSP ６０であるこ とが確認された。 ３．大腸菌の HSP ６０がペリプラズム（ま たは菌体表面）にある可能性が示唆され た。

15 NATURE Vol 392 1998

16

17 リゾチーム処理直後の菌体（ E.coli ）にみられた spirosome （第 80 回報告） 100 nm 菌体 ３分後に表面から離脱する長い spirosome が見られ た 規則的配列構造が見られた Clostridium hiranonis の規則 的配列構造と比 較した部分