生体試料を用いた 環境中有害化学物質暴露の健康影響評価 兵庫県環境研究センターの役割 ・分析方法の開発 ・生体試料の採取と健康状況調査

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1 生体試料を用いた 環境中有害化学物質暴露の健康影響評価 兵庫県環境研究センターの役割 ・分析方法の開発 ・生体試料の採取と健康状況調査
2012．03.17　最終ミーティング（神戸）　 生体試料を用いた 環境中有害化学物質暴露の健康影響評価 兵庫県環境研究センターの役割 ・分析方法の開発 ・生体試料の採取と健康状況調査 ・生体試料中有害化学物質濃度の測定 （POPs，PCB, Pesticides, PFCs, PAHs） ・プロファイリングと健康影響評価 松村千里、鶴川正寛、羽賀雄紀、鈴木元治、竹峰秀祐、奥野俊博、中野武

2 1．RP-カラム（試作品）による抱合体の保持
報告内容 1．RP-カラム（試作品）による抱合体の保持 ・グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体の保持 ・充填量を240mgに増加したRP-SAX、RP-WAXの使用 2．尿中のPFCs濃度 ・分析方法の検討及び測定結果 3．尿中のPOPs、PCB濃度 ・分析方法の検討及び測定結果 4．尿中のOH-PCBs濃度 ・分析方法の検討及び測定結果 ・PCB取扱者の尿中濃度測定結果

3 1．RP-カラムによる抱合体の保持 p-NPG + H2O Glucuronic acid + p-NP
4-Nitrophenyl beta-D-Glucuronide(p-NPG)を用いてRP-SAX、RP-WAXによるグルクロン酸抱合体の保持、尿色素との分離を検討 p-NPGの構造式 β-Glucuronidase p-NPG + H2O Glucuronic acid + p-NP

4 1．By RP-columnによる抱合体の保持
Separation of p-NPG and urine 色素　by RP-SAX（240mg） Sample: Water 100mL, Urine 35mL p-NP Sample +p-NPG RP-SAX urine色素 p-NP ○ － ◎ 100% 1 Ethyl acetate 6mL 2 2% HCOOH/MeOH 4mL 3 5% HCOOH/MeOH 4mL 4 10% HCOOH/MeOH 4mL urine + 0.02M phosphoric buffer（pH7） + β-Glucuronidase(140U/mL) Incubation 37 deg, 1hr OD measurement λ=405mm

5 1．RP-カラムによる抱合体の保持 Separation of p-NPG and urine 色素 by RP-WAX（240mg）
Sample: 1%NaClaq 50mL, Urine 260mL(Aろ紙で濾過、2分割） Sample +p-NPG p-NP RP-WAX urine色素 p-NP ○ － △ 10% 18% 30% 0% ◎ wash Water 5mL 1 MeOH 5mL 2 0.001% NH4OH/MeOH 5mL 3 0.002% NH4OH/MeOH 5mL 3 0.005% NH4OH/MeOH 5mL 尿色素 3 0.01% NH4OH/MeOH 5mL 3 0.05% NH4OH/MeOH 5mL 3 0.1% NH4OH/MeOH 5mL Incubation OD measurement λ=405mm

6 1．RP-カラムによる抱合体の保持 Phenolphthalein（PP）のグルクロン酸抱合体、硫酸抱合体を用いてRP-SAX、RP-WAXによる保持、尿色素との分離を検討 P-NPと構造の異なるPPを用いることで、新しいカラムの吸着性能を確認 PPの構造式（pH<8.3） PPのグルクロン酸抱合体 Phenolphthalein-β-D-Glucuronide･Na salt (PPGNa) PPの硫酸酸抱合体 Phenolphthalein-Disalfuric acid･3K salt hydrate (PPSAK) 分解酵素 β-Glucuronidase/arylsulfatase (GN-ASEz)

7 グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体の保持、溶出パターン
1．RP-カラムによる抱合体の保持 グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体の保持、溶出パターン Sample Sample RP-WAX RP-SAX 0.01% NH4/MeOH 2mL 1 Ethyl acetate 6mL 1 5% HCOOH/MeOH 4mL 2 0.1% NH4/MeOH 5mL　 2 10% HCOOH/MeOH 4mL 3 Sample 媒体 RP-WAX RP-SAX 1 2 3 0.01% 0.1% 5% 10% グルクロン酸抱合体 （p-NPG ＋PPGNa） Water ++ - （PPGNa） Urine +? ++? 硫酸抱合体（PPSAK） + p-NP、PPのグルクロン酸抱合体はRP-WAX,RP-SAXともに同様の挙動。 PPの硫酸抱合体はRP-WAXでグルクロン酸抱合体と似た挙動。 しかし、RP-SAXでの保持、溶出方法は不明。 50%でも不検出

8 1．RP-カラムによる抱合体の保持 まとめ ・ RP-WAX、RP-SAXは、尿中のグルクロン酸抱合体（p-NPG, PPGNa）を濃縮するのに有効である。 ・RPカラムに保持されたグルクロン酸抱合体は、RP-WAXでは0.1%NH4OH/MeOH、RP-SAXでは10%HCOOH/MeOHで溶出される。 ・尿中の硫酸抱合体（PPSAK）は、RP-WAXで濃縮可能であり、溶出はグルクロン酸抱合体と同様のフラクションである。 ・尿色素との分離は困難であることから、別途クリーンアップが必要である。

9 2．尿中のPFCs濃度 分析方法の検討及び測定結果

10 2．尿中のPFCs濃度 2.1 分析手順 Sample Sample 1 Urine (Mr.N) 100mL + Ez 2
2.1　分析手順 Sample 遠沈 or ろ過後2倍希釈し、 2つに分割してそれぞれカラムに通水 Sample 1 Urine (Mr.N) 100mL + Ez 2 Urine(Mr.N)　100mL　 3 Urine(Mr.S)　60mL + Ez RP-WAX add surrogate MeOH 3mL　 fraction 1 0.01% NH4/MeOH 5mL　 fraction 2 0.1% NH4/MeOH 5mL　 fraction 3 Each fraction concentrated to near dry add 0.02M phosphoric buffer（pH7）　3mL add GN-ASEz (2.2mM)　10uL Incubation 37 deg, 1hr add 0.1M TBA 5mL add 0.25M carbonic buffer 10mL add MTBE 15mL Extraction with MTBE Concentration dehydration, chang the solvent to MeOH LC/MS add SYS ※RP-WAX通過水はPR-SAXを用いて処理

11 2．尿中のPFCs濃度 2.2 サロゲート回収率 Urine (Mr.N) Urine (Mr.S) Urine (Mr.N) 酵素処理なし
2.2　サロゲート回収率 MeOH 3mL　 0.01% NH4/MeOH 5mL　 0.1% NH4/MeOH 5mL　 fraction 1 fraction 2 fraction 3 Urine (Mr.N) Urine (Mr.S) Urine (Mr.N) 酵素処理なし Water

12 2．尿中のPFCs濃度 2.3 分析結果 昨年度と同様にPFCAsでは低炭素鎖のものが主に検出。PFASsはほとんど検出されず。
2.3　分析結果 Urine (Mr.N) Urine (Mr.S) 昨年度と同様にPFCAsでは低炭素鎖のものが主に検出。PFASsはほとんど検出されず。 （注）濃度レベルは<1～100 pg/mLであり、昨年度（<1～30 pg/mL）よりやや高めであるが、回収率が悪く、検出強度が小さいことから参考値とする。

13 3．尿中のPOPs、PCBs濃度 分析方法の検討及び測定結果

14 RP-WAX＋PS-2 （or RP-SAX）
3．尿中のPOPs、PCBs濃度 3.1　分析手順 Sample 1 Urine (Mr.N) 90mL + Ez 2 Urine(Mr.N)　90mL　 Sample ろ過（5A）後2 倍希釈 add surrogate PS-2 RP-WAX＋PS-2 （or RP-SAX） 0.1% NH4/MeOH 6mL　 DCM 30mL　 concentrated to near dry Sample1のみ add 0.02M phosphoric buffer（pH7） add GN-ASEz (2.2mM)　10uL Incubation 37 deg, 1hr chang the solvent to Hx Extraction with Hx Clean up LC-Si Concentration 100uL HRGC/HRMS add SYS

15 3．尿中のPOPs、PCBs濃度 3.2　POPsサロゲート 　　　回収率 ※後段のPS-2（RP-SAX）からは不検出。

16 3．尿中のPOPs、PCBs濃度 3.3　POPs分析結果

17 3．尿中のPOPs、PCBs濃度 3.4 PCBsサロゲート回収率
回収率は、1～4塩素体で40～70%程度であり。5塩素体以上では10～30%程度であった。後段のPS-2、SAXからはPCBは不検出であったことから、WAXからの破過はなかったと考えられる。

18 3．尿中のPOPs、PCBs濃度 3.5 PCBs分析結果

19 4．尿中のOH-PCBs濃度 分析方法の検討及び測定結果

20 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.1　酵素処理によるロス（分解、揮発など）のチェック

21 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.2 RP-WAX、RP-SAXの回収率 RP-WAX RP-SAX
尿試料5mLにOH-PCB標品混合液及びサロゲートを添加し、RPカラムに通水。 充填量120mg RP-WAX RP-SAX

22 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.3 分析手順 充てん量は240mg 尿200ml通液するのに４本を要した Sample 200mL
4.3　分析手順 Sample 200mL filtration 5A filter Sample 1 Urine (Mr. N, ) dilution ×1/2 by Water RP-WAX ×4本 充てん量は240mg 尿200ml通液するのに４本を要した MeOH 6mL 1 Pass water 4 0.01% NH4/MeOH 6mL 2 0.1% NH4/MeOH 6mL　 3 1-3 fraction add surrogate 20uL concentration add 0.02M phosphate buffer（pH7）3mL add GN-ASEz 20uL Incubation 37 deg, 90min Extraction with Hx shaking dehydration, concentration OH-PCB pretreatment

23 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.4 尿中OH-PCBsのマスクロマトグラム OH-TrCBs OH-TeCBs OH-PeCBs
OH-HxCBs

24 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.4 OH-PCBs分析結果 尿からはOH-PCBsが6.2 ng/Lで検出され、
5塩素体、6塩素体が主であった。

25 2～4．尿中のPFCs、POPs、PCBs及びOH-PCBsの測定
まとめ RP-WAXを用いて尿中のPFCs、POPs、PCBs及びOH-PCBsを測定することは可能であったが、一部回収率の悪いものがあった。 抱合体酵素分解処理を行ったが、PFCs、POPs、PCBsのグルクロン酸抱合体及び硫酸抱合体は、検出濃度が低く増加傾向が確認できなかった。 OH-PCBsについては、抱合体酵素分解処理を行わないと測定ができなかったことから、尿中に抱合体として排出していることが示唆された。

26 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.5　PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化

27 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.5　PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化

28 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.5　PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化

29 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.5　PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化

30 尿中OH-PCBsのマスクロマトグラム(OH-TrCBs)
4.5　PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化 PCB作業従事者 （No.44） 60代 一般成人男性 20代 一般成人男性 　尿中OH-PCBsのマスクロマトグラム(OH-TrCBs)

31 尿中OH-PCBsのマスクロマトグラム(OH-TeCBs)
4.5　PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化 PCB作業従事者 （No.44） 60代 一般成人男性 20代 一般成人男性 　尿中OH-PCBsのマスクロマトグラム(OH-TeCBs)

32 尿中OH-PCBsのマスクロマトグラム(OH-PeCBs)
4.5　PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化 PCB作業従事者 （No.44） 60代 一般成人男性 20代 一般成人男性 　尿中OH-PCBsのマスクロマトグラム(OH-PeCBs)

33 尿中OH-PCBsのマスクロマトグラム(OH-HxCBs)
4.5　PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化 PCB作業従事者 （No.44） 60代 一般成人男性 20代 一般成人男性 　尿中OH-PCBsのマスクロマトグラム(OH-HxCBs)

34 4．尿中のOH-PCBs濃度 4.5　PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化

35 4.5 PCB取扱い作業に係るOH-PCBs濃度の変化
まとめ

36 5．今後の検討課題