海洋生命・分子工学基礎実験 タンパク質の取扱い （4）

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1 海洋生命・分子工学基礎実験 タンパク質の取扱い （4）
細胞分子工学研究室担当

2 5．SDS-ポリアクリルアミド ゲルの調製　

3 まずは・・・ ゲル板を組み立てる 当日実演します メモの用意を！

4 使う溶液 1． A 液 （30% アクリルアミド水溶液） 2． B 液 （Lower Gel Buffer） 3． C 液 （Upper Gel Buffer） 4． D 液 （10% 過硫酸アンモニウム ammonium peroxodisulfate = APS） 5． E 液 （10% テトラメチルエチレンジアミン tetramethylethylenediamine = TEMED）

5 分離ゲル （separation gel = running gel）
以下の溶液を混ぜる（12.5% アクリルアミド） A 液：　3.47 mL （3470 mL） B 液：　2.08 mL （2080 mL） 蒸留水：　2.78 mL （2780 mL） ここまで混ぜたら脱気 D 液：　28.5 mL E 液：　85 mL D 液と E 液を加えたらすばやく混ぜてゲル板に流し込む

6 分離ゲル （separation gel = running gel）
ガラス板に流し込んだら，上に静かに水飽和 1-ブタノールを 載せる 1-ブタノールはアクリルアミド水溶液とは混ざらない ゲルの上の端が平らになるように約 30 分静置してゲルを固 める 固まったらブタノールを捨て，水道水→蒸留水で洗う 残った水をろ紙で拭き取る

7 濃縮ゲル （stacking gel） 以下の溶液を混ぜる A 液： 375 mL C 液： 625 mL
蒸留水：　1.5 mL （1500 mL） ここまで混ぜたところで脱気 D 液：　7.5 mL E 液：　50 mL D 液と E 液を加えたらすばやく混ぜてゲル板に流し込む

8 濃縮ゲル （stacking gel） 気泡を閉じ込めないように，サンプルコウムを差し込む 30 分間ほど静置し，ゲルを固める
固まったら，サンプルコウムとシールガスケットを取り外し， 水でぬらしたキムワイプと一緒に，ラップで包んで冷蔵保存 する（数週間は保存可能）

9 サンプルの調製 SDS サンプルバッファー 10% (w/v) グリセリン 5% (v/v) 2-メルカプトエタノール
2.3% (w/v) SDS 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8) 当日は上記のサンプルバッファーの 2 倍濃縮ストック溶液を 使用します（次のスライド）

10 2x SDS サンプルバッファー のつくり方 以下のものを混ぜて 10 mL とする 50% グリセリンを 4 mL
SDS の粉を 0.46 g 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) を 2.5 mL 蒸留水を 2.5 mL 少量のブロモフェノールブルーの粉を溶かす