L型菌によってアジュバント病 が起こる可能性について

1 【目的】我々はL型菌の病原性を検討しており、第80回本学会西日本地方会にて、L型菌のナノサイズ微小細胞が、粒子状アジュバントとしての作用を持つ可能性を報告した。今回は、L型菌の特殊性（極端な大小の細胞を形成する、持続感染する、アジュバント作用を持つ可能性がある）によって、川崎病や他の膠原病を発症する可能性を検討する。 【方法】これまでに我々が報告した実験結果と、L型菌、マイコプラズマ、アジュバント病、遷延感作に関する文献検索によって、膠原病、特に川崎病について考察する。 【結果と考察】 川崎病は未だに原因不明であるが、微生物感染が関連すると考察する論文は多い。我々は原因がL型菌である可能性を検討している。まず、大腸菌や、そのL型菌のHSP60は、ペリプラズムに局在する可能性があることを示し（第82回日本細菌学会総会）、川崎病でBCG部位が発赤する事との関連性を検討した。　次に化膿レンサ球菌L型菌124L株ではストレプトリジンOとストレプトキナーゼが発現されない事を示し、この様なL型菌感染ならば川崎病患者のASLO値やASK値が上昇しない可能性がある事を示した（第79回本学会西日本地方会）。また、この124L株は親株よりヒアルロニデースを多く産生し、L型菌化しても、一部の病原因子は強く発現される可能性がある事を示した（第84回本学会総会）。更に、L型菌で形成されるナノサイズの微小細胞の細胞表面に蛋白等の抗原が吸着する可能性も検討され、L型菌が粒子状アジュバントとして働く可能性を示した（第80回本学会西日本地方会）。これらの実験結果に、マイコプラズマ肺炎が自己免疫疾患症状を呈する事、4年周期で流行したとの疫学的情報、アジュバント病の知見、遷延感作実験の研究報告等を合わせて考察した結果、L型菌による粒子状アジュバント作用と持続感染による遷延感作、という機序によってアジュバント病が起こり、川崎病（膠原病）の複雑な病態が形成されるのではないかと考えられた。

2 L型菌について ●　浸透圧を高めた培地中でペニシリンやリゾチームなどを菌体に作用させる　　と、細胞壁のない細菌が誘導でき、その状態で継代培養も可能である（ペニシリン加高張液培地使用）。この様な、細胞壁の無い状態で増殖可能な菌をL型菌と呼ぶ。 ●　マイコプラズマと類似する形態だが、DNA量やGC含量比などの点で基本的に異なる。マイコプラズマはヒトや家畜等に感染して肺炎や関節炎を起こす。 ●　通常、培養条件を変える（培地からペニシリンを除いたり、浸透圧を下げるなど）と、細胞壁のある親株に復帰し、復帰した親株は初回よりも容易にL型菌になる。長期継代により親株に復帰しにくい安定型L型菌もできる。 ●　多くの病原菌で、L型菌が誘導されている。 ●　ヒトや家畜、魚類等の体内からL型菌が分離されている。 ●　L型菌が原因と特定された疾患はいまだ報告されていない。 ●　動物実験では L型菌接種で病変が生じるという報告も、生じないという報告もある。 ●　L型菌は実験動物体内で持続感染することが報告されている。

筆者らのこれまでの検討結果 3 ① ② ③ ④ L型菌では、HSP60は細胞表面または外界に分泌されると考えられる。 ②　 ③　 ④ L型菌では、HSP60は細胞表面または外界に分泌されると考えられる。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(2008, 細菌学会　支部総会） 　川崎病のBCG接種部位発赤と関連する可能性がある。 化膿レンサ球菌のL型菌には、ストレプトリジンO、ストレプトキナーゼを産生しない株が出現する。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(2009　感染症学会支部総会） 　川崎病患者にASLO、ASKが検出されない事と関連する可能性がある。 化膿レンサ球菌のL型菌には、親株より多くのヒアルロニダーゼを産生する株 がある。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(2010　感染症学会総会）　 川崎病患者の病態と関連する可能性がある。 L型菌の微小細胞は粒子状アジュバントとしての作用を持つ可能性がある。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ 2010 　感染症学会支部総会）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　川崎病（膠原病）の複雑な免疫反応と関連する可能性がある。 これまで、我々は、 溶連菌のL型菌を　調べて HSP６０の局在、 SLO、SK産生 ヒアルロニダーゼの産生能 について、川崎病との関連を 報告してきました。 、

① L型菌では、HSP60は細胞表面または外界に分泌されると考えられる(2008, 細菌学会） 4 ①　L型菌では、HSP60は細胞表面または外界に分泌されると考えられる(2008, 細菌学会） 大腸菌スフェロプラストを1.75％　NaCl液に懸濁し、菌体が破砕しないように攪拌した。その前後の蛋白の比較　　 94- 67- 43- 30- １ ２ ３ kDa 　　　１．　撹拌前のスフェロプラスト菌体　 　　　２．　撹拌後のスフェロプラスト菌体　 　　　３．　上清成分。　 Spirosome（ペリプラズム局在を確認） 60kDa（ＨＳＰ６０と確認） この攪拌実験の結果をさらに確かめるため、菌の培養条件や塩濃度をいろいろ変えて実験しましたところ、 図のようなデータがでてきました。 ここにスパイロソームと同様に、攪拌前にある蛋白で、攪拌後の細胞にはなくて上清に現れるものがあったのです。 分子量を調べると丁度６０キロダルトンの蛋白でしたので、 HSP６０ではないかと思い、高温培養でこのバンドが増えるかどうかを確かめました。 スライドチエンジ ＨＳＰ６０は攪拌後のスフェロプラスト菌体内には無く、上清に検出されたため、ペリプラズム局在が示唆された。同じ挙動をとったＳｐｉｒｏｓｏｍｅは電顕でペリプラズム局在が証明されたので、Ｌ型菌でもＨＳＰ６０はペリプラズムに局在すると考えられた。Ｌ型菌になると、親型に復帰できる非安定型ではＨＳＰ６０が検出されるが、長期に継代された安定型Ｌ型菌では、ＨＳＰ６０がかなり減少していた。細菌のＨＳＰ６０は細胞壁合成に関連していると考えられ、Ｌ型菌が細胞壁を再合成する場合はＨＳＰ６０は細胞表面に発現し、細胞壁が完成するまでは、菌体外にも放出される可能性があると考えられた。　

② 化膿レンサ球菌のL型菌には、ストレプトリジンOを産生しない株が出現する(2010 細菌学会） 5 ②　化膿レンサ球菌のL型菌には、ストレプトリジンOを産生しない株が出現する(2010　細菌学会） 化膿レンサ球菌L型菌１２４L株の好気培養による羊血液寒天培地（3.5％NaCl）での溶血反応 a: K6169株（野生株）, 　　　b: 124P株（親株） , 　　　c:124L株（Ｌ型菌） 菌の増殖が分かる角度で撮影　　　　　　溶血帯を示す透過光で撮影 a b a b c c Ｌ型菌１２４L株はストレプトリジンＯを産生していない（ウエスタンブロッティングでも確認）

② 化膿レンサ球菌のL型菌には、ストレプトキナーゼを産生しない株が出現する(2010 細菌学会） 6 ②　化膿レンサ球菌のL型菌には、ストレプトキナーゼを産生しない株が出現する(2010　細菌学会） 化膿レンサ球菌 L 型菌１２４ L 株のストレプトキナーゼ産生に関するドットブロティング解析　　　Anti-streptokinase rabbit polyclonal antibody　(1：12000希釈） K5866 株 　 　　K6169 株　　 124 L 株 野　生　型 L　型　菌 次に、 ストレプトキナーゼを見てみました。 この抗体では、ウエスタンブロッティングがあまり、うまくいきませんでしたが、 ドットブロッティングでは、このように、 こちらの　野生型に比べて、 　Ｌ型菌株では、抗体への反応が見られませんでした。 これらの結果から、 このＬ型菌124Ｌ株ではＳＬＯ・ＳＫ　ともに産生されていなものと思われました。 Ｌ型菌１２４L株はストレプトキナーゼを産生していない

③ 化膿レンサ球菌のＬ型菌には親株より多くの ヒアルロニダーゼを産生する株がある 7 ③　化膿レンサ球菌のＬ型菌には親株より多くの 　　ヒアルロニダーゼを産生する株がある 野生型と L 型菌のヒアルロニダーゼ産生量の比較 Anti－sheep　hyalunonidase polyclonal rabbit IgG(NOR)によるウエスタンブロティング解析 ９４ｋ ６７ｋ ４３ｋ K５８６６株 K６１６９株 １２４ L 株 ６７ｋ ４３ｋ ３０ｋ １２４P 株 K６２７４株 １２４ L 株 L型菌の抗ヒアルロニダーゼ抗体に反応するバンドは野生型より濃厚であった

④ L型菌の微小細胞は粒子状アジュバントとしての作用を持つ可能性がある。 8 ④　L型菌の微小細胞は粒子状アジュバントとしての作用を持つ可能性がある。 L 型菌の電子顕微鏡像 L型菌の特性：　増殖過程で大小の細胞ができ、微小な粒子も生じる（左図の球形粒子は全てＬ型菌粒子） 電顕で見ますと 極端に 大小の細胞がみられます。 1μm Staphylococcus aureus　L 型菌 　　Eda　T.　ら、１９７７より Eda T． et al．1977．Extracellular membranous structures in a stable L-form of Staphylococcus aureus．J．Gen．Microbiol．103：189-191

L型菌の特性： １００nm以下の粒子も生じている 9 L 型菌の電子顕微鏡像 L型菌の特性：　１００nm以下の粒子も生じている 100 nm １００　ナノメーター以下の 微小な細胞も 観察されます。 Proteus mirabilis　L型菌 　　Eda, T.　ら、１９７８ より Tohru Eda et al．1978．Ultrastructure of an unstable L-form strain P42L of Proteus mirabilis．J．Electron Microsc．27(2)： 119-126

10 文献に示されたL型菌のサイズ調査 L型菌の菌体サイズは 16 ナノメートル ～ 100 ミクロンメートル 菌種 　　　　　　　　 大型細胞（ mm　）　微小細胞（　nm　） Proteus mirabilis 4 　　 16 (TOHRE EDA et al. 1978) Brucella suis 0.7 　　 47 (J.SCHMITT SLOMSKA et al.1982) Proteus mirabilis 2.5 　　 83 (HEIN-PETER KROLL et al. 1980) Escherichia coli 1.7 　　 111 (TOHRE EDA et al. 1976) Pseudomonas aeruginosa 0.9 　　 125 (EARL G.HUBERT et al. 1971) Streptomyces hygroscopicus 5 　　 20 (J. GUMPERT 1983) Bacillus licheniformis 2 　　 55 (PRISCILLA B.WYRICK et al. 1973) group B Streptococcus 3.6 　　 66 ( N.C. CHURLOVA et al. 1986) Streptococcus pyogenes 6.2 　　 71 (TOHRE EDA et al. 1979) Streptococcus faecalis 9 　　 80 (MARY T.GREEN et al. 1974) Staphylococcus aureus 5 　　 83 (TOHRE EDA et al. 1977) Staphylococcus aureus 80 　　　- (TOYOZOH TAKAHASHI et al. 1981) Streptococcus faecium 100 　　 500 ( DAVID J BIBEL et al. 1975) 文献で、 調べて見てみますと この菌では、4ミクロンから、16ナノメートルの細胞が、 この菌では、 ０．７ミクロンから、４７ナノメートルの細胞が 見られる訳ですが、 大きな細胞は　１００　ミクロンの大きさから 微小細胞は　　１６　ナノメートルまで できる、ことが分かりました。 L型菌の菌体サイズは 16 ナノメートル　～　100 ミクロンメートル

11 粒子状アジュバント：　免疫学におけるアジュバントとは抗原と共に生体に接種すると、その抗原性を増強して強い免疫反応を引き起こす物質で、その中でも、微粒子状の形態を持ち抗原と結合することで、その作用を発揮するものを粒子状アジュバントと分類する（水酸化アルミニュウム、シリコン、パラフィン、プリスタンなど） フロイントのアジュバントの形態 Emulsion of water-in-oil ちなみに、これは 有名な、フロイント　アジュバントの論文に でてくる　Water in oil の図です。 オイルアジュバントはこのような、大小の粒子 でできていることを しめしています Freund, J., and Bonanto,M.V.: J.Immunol., 48:325-334, 1944より

L型菌のサイズ L型菌のサイズは粒子状アジュバントになりうる 12 ウイルス 20～300nm 細 菌（野生型） 0.5～10μm 細　菌（野生型） 0.5～10μm 粒子状アジュバント 20～500nm 原　虫 １～60μm L　型　菌 16 nm～100μm そうしますと この、L型菌のサイズは ウイルス　サイズ　から 原虫のサイズ、まであり、 粒子状アジュバントとして用いられている粒子も この中に入ります。 従って L型菌は、サイズの上では 十分に、粒子状アジュバントになりうる、ということが示唆されます L型菌のサイズは粒子状アジュバントになりうる

血清加培地で培養したL型菌と野生型菌のアルブミンの吸着 L 型菌は 野生型より多くの培地由来アルブミンが吸着すると考えられた 13 Ｌ型菌菌体表面に外来抗原が吸着する可能性はあるか？ 血清加培地で培養したL型菌と野生型菌のアルブミンの吸着 Sheep anti-bovine albumin antibody によるウエスタンブロッティング 94- 67- 43- １ ２ ３ kDa ４ １. アルブミンマーカー ２．K6169 株 (野生型） ３．１２４ P 株 (野生型親株） ４．１２４ L 株 ( L 型） １　は　アルブミン蛋白です。 ２　は　野生型 ３　も　野生型 ４　が　L型菌です。 こちらが一回目、こちらが　2回目の観察です。 この用に、 野生型にはバンドが見えず L型菌にバンドが見られました、 L型菌は微小細胞が多いので 表面積が大きくなるためではないか、 という、問題はありますが、 とりあえずは、 L型菌にアルブミンが多く吸着していることが示唆されるのではないか、 と　考えられます。 観察　１回目 観察　２回目 L 型菌は 野生型より多くの培地由来アルブミンが吸着すると考えられた

L型菌が粒子状アジュバントとして作用する可能性 が考えられた。 14 マイコプラズマでも、菌体に培地血清蛋白が吸着することが報告されている L型菌に似た　マイコプラズマでも、 細胞表面に培地成分のアルブミンや他の蛋白が結合して、 洗浄したぐらいでは、落ちない、 ということが報告されています。ので、Ｌ型菌でもその可能性が高いと考えられます。、 L型菌が、粒子サイズの点と、 蛋白吸着の可能性がある、という、２点から 体内で、粒子状アジュバントとして、作用する可能性がある のではないか、と考えられます。 それを検証した、実験は、調べた限りでは、見当たりませんが、 動物に接種した実験はかなり、成されています。、 L型菌細胞のサイズと蛋白の吸着性から、 L型菌が粒子状アジュバントとして作用する可能性 が考えられた。　

川崎病の病原体としてL型菌を検討する理由 15 川崎病の病原体としてL型菌を検討する理由 ①　Ｌ型菌は未だ十分には検討されていない ② 　病巣部からL型菌様の微生物が検出されている ③　ペニシリン系の抗生物質が無効である ④ 　川崎病は抗生物質の使用開始の頃より発生し始　　 　　め、日本に多い（体内L型菌の増加と一致？）　 川崎病の病原体として L型菌は　いまだ十分には 検討されていないのでは、とおもいまして、 調べております。

川崎病は何らかの感染症が関与していると考えられている 16 川崎病は何らかの感染症が関与していると考えられている 原因候補に上がった微生物やその成分 化膿レンサ球菌　（1974） アクネ菌　（1983）　 EBウイルス （1984）　　 アデノウイルス（ 1985 ）　 ダニ　（ 1985 ）　 ストレプトコッカス　サンギウス （ 1985 ） レトロウイルス（ 1986 ）　 ヒトヘルペスウイルス （ 1990 ）　 スーパー抗原 （ 1992 ） ブドウ球菌（ 1993 ）　 腸内細菌（ 1993 ） ヒトパルボウイルス（ 1995 ） エルシニア（ 1997 ） コリネバクテリウム（ 1999 ）　 クラミジア（ 1999 ） 麻疹ウイルス（2000 ） マイコプラズマ（ 2001 ） コロナウイルス （ 2005 ） リケッチア　 カンジダ　 クラミジア　　 リステリア ナイセリア　 ストレプトコッカス　ビリダンス　 水痘ウイルス　 RNAウイルス（ 2006 ）　 複数細菌 （ 2009 ）　 川崎病の病原体として 色々な、微生物が検討されれましたが、 調べた限りでは、 L型菌は　まだ 検討されていない　　と 思われます。 L型菌はまだ十分には検討されていない

川崎病・膠原病機序解明に関する論文報告 17 ●遷延感作実験 （岡林ら、１９５９ 塩沢ら、２００９） ●遷延感作実験 （岡林ら、１９５９　塩沢ら、２００９）　　 異種蛋白の遷延感作（長期にわたる抗原の繰り返し刺激）の末期にジスガンマ‐グロブリン血症、他の膠原病病態が出現する（実験的膠原病）。　塩沢らの自己臨界点説 ●シリコンによるヒトアジュバント病 （三好ら、１９６４）　 体内で漏出したシリコン微粒子のアジュバント作用により、種々の膠原病病態が出現 ●川崎病モデルマウス （秋山ら、１９８３） 出生早期に細胞外増殖型溶連菌（ペニシリン処理）を感染させ、４週後に細胞内増殖型溶連菌を感染させると川崎病類似の病態が出現 ●　川崎病の合成洗剤、　カーペット洗剤説 　　アメリカではカーペット洗浄と川崎病との関連が疑われ、カーペット洗剤説が呈示された。（成分のABSは粒子状アジュバントになる） ●プリスタンによる RA、SLE モデル (Potterら、１９８１ Satohら、１９９４） プリスタンオイル（粒子状アジュバント）のみの一回の腹腔接種で、膠原病類似の病態が出現 ●川崎病モデルマウス （藤本ら、２０１０） レンチナン（β‐グルカン）の腹腔接種で川崎病類似の病態が出現 川崎病、膠原病の機序解明に関する報告を見ますと、 ●岡林、塩沢先生らの、遷延感作実験、 ●シリコンによるヒトアジュバント病、 ●異なるタイプの溶連菌接種による　川崎病モデルマウス、 ●プリスタンオイルアジュバント接種による、膠原病のマウスモデル ●レンチナン、粒子状アジュバントの一つですが、腹腔接種による川崎病モデルマウス などの報告があります。 この秋山先生らの報告では、 まず、細胞外増殖性の溶連菌を感染させ、4週間後に、細胞内増殖性溶連菌を感染させる、、というものですが、この細胞内増殖性溶連菌というのは、Ｌ型菌に変化し易い株で、Ｌ型菌が細胞内増殖をしているのでは、ないかと思われます 全体を見ますと、膠原病は、遷延感作とアジュバント作用が強く、関連していると思われますが、 L型菌は、この両方の作用をもっている可能性がある、と考えられます、 これらの報告から、川崎病（膠原病）には遷延感作作用や粒子状アジュバント作用の機序が関与していると思われ、L型菌は、その両方の作用をもつ可能性があると思われる。

L型菌が粒子状アジュバントとして作用する可能性 18 L型菌が粒子状アジュバントとして作用する可能性 微生物による粒子状アジュバント作用 で　は ナノサイズ、蛋白吸着という条件を満たす ウイルスやマイコプラズマも 粒子状アジュバントになる可能性があるか? そこで、 L型菌の　アジュバントサイズの表面に　抗原を吸着する性質があれば、 （生体内で）　この辺が問題ですが アジュバントとして作用するのではないか、 と 考える訳ですが、 では、アジュバントサイズである　ウイルスでも その表面に抗原を吸着する性質があれば 、 アジュバントとして作用するのか、 という疑問が　わいてくるのですが、 これを　調べて見ますと、、、、

19 不活化日本脳炎ウイルス粒子をアジュバントとして使用する方法が報告されている 2009 これは、化血研の先生がたが 昨年、出されました特許申請ですが 不活化日本脳炎ウイルス粒子をアジュバントとして使用する方法 というタイトルになっています。 拝見いたしましたところ、 ウイルス粒子を抗原液に加えて　接種することで　 それらの抗原に対する、より早く　強い免疫が誘導された､　 という多くの実験をされていまして、 私の理解するところでは、粒子状アジュバントとして働いたものと 思われます。 課題を解決するための手段[0010][3]　不活化日本脳炎ウイルスが粒子状構造であることを特徴とする （World Intellectual Property Organization/2009/147980　より） ウイルス粒子も　（粒子状）アジュバントになる

推測される L 型菌の作用 20 樹状細胞 粒子状アジュバント作用 L型菌 毛細血管の塞栓 結合組織への侵襲 マクロピノサイトーシス マクロファージ 擬似ウイルス 擬似寄生虫 免疫複合体形成 親株へ復帰 毒素の再産生 持続・潜伏感染 毛細血管 遷延感作作用 血管内皮細胞への吸着 細胞外増殖 貪食細胞内増殖

× L型菌は様々な変化が可能である 多くの病原菌種が L 型菌になる 多くの疾患・病態の発現が 可能と考えられる 21 ウイルスサイズ　　　細菌サイズ　　　寄生虫サイズ 細胞内寄生　　　　　　　細胞外寄生 不顕性感染（持続感染）　　　　　　　　顕性感染 増殖性細胞　　　　　　　非増殖性細胞(サイズ100nm以下粒子） 一部細胞壁成分あり　　　　　 細胞壁成分なし L型菌相　　　　　　　　　野生型相(親株への復帰）　 ×　　　 多くの病原菌種が L 型菌になる　 多くの疾患・病態の発現が 可能と考えられる　

現在、原因としてL型菌が疑われている膠原病 22 現在、原因としてL型菌が疑われている膠原病 ●サルコイドーシス Etiology of sarcoidosis : the role of Propionibacterium acnes.　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(Eishi Y, ら　2003） Histologic obserbations of variably acid-fast pleomorphic bacteria in systemic sarcoidosis (Cantwell AR Jr. 1982) ●全身性エリテマトーデス Histologic Observation of Coccoid Forms Suggestive of Cell Wall Deficient Bacteria in Cutaneous and Systemic Lupus Erythematosus 　　　　　　　　 　　　 　　　　　 (Cantwell AR Jr. ら　1982)

23 ま　と　め 　L型菌による粒子状アジュバント作用と持続感染による遷延感作作用（未確認）という機序によってアジュバント病が起こり、川崎病（膠原病）の複雑な病態が形成されるのではないかと考えられた。 　　まとめますと、 L型菌細胞は、 粒子状アジュバントとして　作用する可能性がある、のではないか、 ということと、　 L型菌の持続感染　という、特殊性から、 長期に、遷延感作を起こす可能性もあり、 これらの機序によって、 川崎病や他の膠原病を起こす、可能性があるのでは ないか、と考えられました。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　以上です。

又吉盛健：演題発表に関連し、開示すべきＣＯＩ関係にある企業などはありません。