微生物学２ 微生物の利用

微生物による医薬品の製造

抗生物質と化学療法薬 抗生物質 化学療法薬 微生物によって生産される抗微生物物質（狭義） 微生物によって生産される化学療法薬（広義） 微生物あるいはがん細胞に対して，その発育や増殖を阻止し， あるいは死滅させる作用のある化学物質

Penicillium chrysogenum ペニシリン系抗生物質 E. coli ペニシリン アシラーゼ 6-アミノペニシラン酸 （6-APA） ペニシリンGの発酵 Penicillium chrysogenum 7 g/L 化学変換 アンピシリン アモキシシリン etc.

Acremonium chrysogenum セフェム系抗生物質 Pseudomonas sp. セファロスポリン アシラーゼ セファロスポリンC Acremonium chrysogenum 7-アミノセファロスポラン酸 （7-ACA） 化学変換 セフカペン ピボキシル セフジトレン ピボキシル etc.

Saccharopolyspora erythraea マクロライド系抗生物質 クラリスロマイシン アジスロマイシン 化学変換 エリスロマイシン Saccharopolyspora erythraea

抗真菌抗生物質 アムホテリシンB Streptomyces nodosus 深在性真菌感染症（注射） 細胞膜エルゴステロールと結合し，細胞膜機能を障害

抗真菌抗生物質 Streptomyces sp. アシラーゼ WF11899A Coleophoma empetri ミカファンギン

抗腫瘍抗生物質 ブレオマイシン Streptomyces verticillus 皮膚がんなどの扁平上皮がん（注射，外用） 作用機序：DNA鎖切断

抗腫瘍抗生物質 ダウノルビシン ドキソルビシン Streptomyces peucetius Streptomyces peucetius 急性白血病（注射） 悪性リンパ腫，肺がん，消化器がん， 乳がん，膀胱がん，骨肉腫（注射） アントラサイクリン系抗生物質 DNAインターカレーター（塩基対の間に挿入）

Streptomyces tsukubaensis 免疫抑制薬 シクロスポリン Trichoderma inflatum タクロリムス Streptomyces tsukubaensis

高脂血症治療薬 微生物変換 ML-236B プラバスタチン Streptomyces carbophilus Penicillium citrinum HMG-CoA還元酵素阻害　→　血中コレステロール低下

微生物によるアミノ酸，核酸の製造

アミノ酸発酵 L-リシン Corynebacterium glutamicum L-グルタミン酸 ビールは大麦から 味の素はサトウキビから L-トレオニン Brevibacterium flavum

核酸発酵 イノシン グアノシン Corynebacterium ammoniagenes Morganella morganii 酸性ホスファターゼ イノシン酸 （カツオ節の旨味成分） グアニル酸 （シイタケの旨味成分）

微生物による糖類の製造

シクロデキストリンの製造 デンプン シクロマルトデキストリン 内部：疎水性 グルカノトランスフェラーゼ 外部：親水性 Bacillus stearothermophilus α-D-グルコース×6 αｰシクロデキストリン α-D-グルコース×7 βｰシクロデキストリン α-D-グルコース×8 γｰシクロデキストリン

発酵による多糖生産 多糖類 構成糖 発酵微生物 用途 多糖類 構成糖 発酵微生物 用途 デキストラン α-1,6ｰグルカン Leuconostoc 血漿増量剤 　mesenteroides クロマトグラフィー用樹脂 ヒアルロン酸 D-グルクロン酸 Streptococcus 化粧品，眼科手術補助剤， N-アセチル-D-グルコサミン 　zooepidemicus 整形外科用注射剤， 創傷の被覆剤 セルロース β-1,4ｰグルカン Acetobacter スピーカーの振動板 　xylinum キサンタンガム D-グルコース， Xanthomonas アイスクリーム用増粘剤， D-マンノース 　campestris 化粧品 D-グルクロン酸

微生物酵素の利用

微生物酵素 酵素 生産菌 酵素反応 用途 アルカリプロテアーゼ Bacillus licheniformis タンパク質分解 洗剤 酵素 生産菌 酵素反応 用途 アルカリプロテアーゼ Bacillus licheniformis タンパク質分解 洗剤 アルカリセルラーゼ Bacillus sp. セルロース分解 洗剤 リパーゼ Thermomyces lanuginosus 脂質分解 洗剤 α-アミラーゼ Bacillus licheniformis デンプン加水分解 デンプン液化 β-アミラーゼ Aspergillus oryzae デンプン加水分解 マルトース製造 プルラナーゼ Bacillus brevis デンプン側鎖分解 マルトース製造 グルコアミラーゼ Aspergillus niger デンプン加水分解 グルコース製造 セルラーゼ Trichoderma reesei セルロース加水分解 食品加工，繊維処理 凝乳プロテアーゼ Rhizomucor pusillus 凝乳 チーズ製造

微生物による食品の製造

食品製造と微生物 発酵 ・微生物が嫌気条件下でエネルギーを得るために有機化合物を酸化して， アルコール，有機酸，二酸化炭素などを生成する過程 　・微生物が嫌気条件下でエネルギーを得るために有機化合物を酸化して， 　アルコール，有機酸，二酸化炭素などを生成する過程 　・微生物を利用して食品や有機化合物を工業的に製造すること 醸造 　発酵作用を利用してアルコール飲料や調味料などを製造すること 　　日本酒，ビール，醤油，味噌，酢

発酵食品と微生物 パン 小麦粉 ＋ Saccharomyces cerevisiae（パン酵母） タンパク質 → アミノ酸（旨味） 　　　タンパク質　→　アミノ酸（旨味） 　　　デンプン　→　二酸化炭素（ふくらみ） 納豆 　　煮大豆　＋　Bacillus subtilis（枯草菌） かつお節 　　茹で干したカツオの薫製　＋　Aspergillus glaucus（コウジカビの仲間） ぬか漬け 　　野菜類　＋　糠中のLactobacillus属細菌など

発酵食品と微生物 ヨーグルト・・・乳，脱脂乳の乳酸発酵 国際規格 　国際規格 　　Lactobacillus bulgaricus ＋ Streptococcus salivarius subsp. thermophilus 　国内販売品 　　ナチュレ恵　Lactobacillus gasseri 　　プロビオヨーグルト　Lactobacillus gasseri 　　ブルガリアヨーグルト　Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 　　　　　　　　　　　　　　　　 Streptococcus thermophilus 　　ビヒダスヨーグルト　Bifidobacterium longum チーズ・・・乳を凝乳酵素で処理後，乳酸菌またはカビによる発酵 　ゴーダ，チェダー　Lactococcus lactis 　カマンベール　Penicillium candida 　ゴルゴンゾーラ　Penicillium glaucum

発酵食品と微生物 くさや ムロアジ，トビウオなどをくさや液に浸して干す Corynebacterium kusaya（くさや菌） 　ムロアジ，トビウオなどをくさや液に浸して干す 　　Corynebacterium kusaya（くさや菌） 　　　アンモニア，酪酸，吉草酸 鮒寿司 　塩漬けしたフナに飯を詰め，嫌気的乳酸発酵 　　Lactobacillus属細菌 　　　乳酸､蟻酸，酢酸，プロピオン酸 シュールストレミング 　塩漬けしたニシンを発酵中に缶詰にする（殺菌しない） 　　Haloanaerobium属細菌（嫌気性菌） 　　　酪酸，プロピオン酸，酢酸，硫化水素

醸造食品と微生物 日本酒 米のAspergillus oryzae（コウジカビ）による糖化， 　　　　Saccharomyces cerevisiaeによる発酵 ビール 　オオムギの麦芽アミラーゼによる糖化，Saccharomyces cerevisiaeによる発酵 ワイン 　ブドウ果汁のSaccharomyces cerevisiaeによる発酵 醤油 　蒸煮大豆と割砕小麦のAspergillus sojaeによる発酵 味噌 　Aspergillus oryzae酵素による煮大豆の分解，酵母，乳酸菌による発酵 酢 　酒類のAcetobacter aceti（酢酸菌）による発酵（好気発酵）

遺伝子工学

遺伝子操作の手法 配列特異的DNA鎖切断 制限酵素 DNA鎖連結 DNAリガーゼ 3'末端への塩基付加 ターミナルデオキシリボヌクレオチジル 　制限酵素 DNA鎖連結 　DNAリガーゼ 3'末端への塩基付加 　ターミナルデオキシリボヌクレオチジル 　トランスフェラーゼ（TdT） DNA鎖複製 　Taqポリメラーゼ（Thermus aquaticus） 逆転写 　AMV (Avian Myeloblastosis Virus)-RT 　MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus)-RT

制限酵素 二本鎖DNAの特定の塩基配列を認識して切断する酵素 ＧＡＡＴＴＣ EcoRI Escherichia coli由来 ＣＴＴＡＡＧ ＧＧＡＴＣＣ ＣＣＴＡＧＧ BamHI Bacillus amyloliquefaciens由来 ＡＡＧＣＴＴ ＴＴＣＧＡＡ HindIII Haemophilus influenzae由来 付着末端（cohesive end）が残る

ＴＣＴＡＧＡ ＡＧＡＴＣＴ XbaI Xanthomonas badrii由来 ＧＧＴＡＣＣ ＣＣＡＴＧＧ KpnI Klebsiella pneumoniae由来 ＧＣＧＣ ＣＧＣＧ HhaI Haemophilus haemolyticus由来 ＧＣＧＧＣＣＧＣ ＣＧＣＣＧＧＣＧ NotI Nocardia otitidis-caviarum由来 付着末端（cohesive end）が残る

ＴＴＴＡＡＡ ＡＡＡＴＴＴ DraI Deinococcus radiophilus由来 ＣＣＣＧＧＧ ＧＧＧＣＣＣ SmaI Serratia marcescens由来 ＧＴＣＧＡＣ ＣＡＧＣＴＧ HincII Haemophilus influenzae由来 ＧＴＴＡＡＣ ＣＡＡＴＴＧ 平滑末端（blunt end）が残る

DNA分子の結合１ ＡＡＴＴ ＴＴＡＡ ＡＡＴＴ ＴＴＡＡ DNAリガーゼによる結合 DNAリガーゼによる結合

DNA分子の結合２ ターミナルデオキシリボヌクレオチジル トランスフェラーゼ（TdT）による付加 DNAリガーゼによる結合 dGTP dCTP ＧＧＧＧ ＣＣＣＣ ＧＧＧＧ ＣＣＣＣ DNAリガーゼによる結合

宿主ｰベクター系 ベクター・・・目的遺伝子の運び手 ・宿主細胞内で安定に複製する ・適当な制限酵素切断点を有する 　・宿主細胞内で安定に複製する 　・適当な制限酵素切断点を有する 　・薬剤耐性などのマーカーを有する シャトルベクター・・・細菌と真核生物双方で増殖できる 大腸菌 プラスミド（pUC系） λファージ コスミド 酵母 シャトルベクター（pUC−酵母ars1） 酵母人工染色体（YAC） 動物細胞 シャトルベクター（pUC−SV40） レトロウイルス（MMLV由来） 昆虫細胞 バキュロウイルス

ブルーセレクション X-gal 非酵素的 二量体化 β－ガラクトシダーゼ 青色色素

遺伝子クローニング クローニング・・・ある生物から特定のDNAを取り出して増幅すること 制限酵素による切断 → ベクターDNAに結合 → 　クローン・・・目的の遺伝子を含む組換え体 　DNA供与体・・・クローニングのためDNAを取り出される生物 ファージベクターを利用したクローニング 　ファージDNAに目的DNAを挿入　→　パッケージング 　パッケージング・・・組換えDNAをファージ粒子に挿入すること 遺伝子ライブラリー（ジーンバンク） 　　制限酵素などで断片化された全ゲノムDNAを含むクローン

クローニングできる遺伝子のサイズ プラスミド（pUC系） ～10 kb λファージベクター ～20 kb コスミド ～40 kb

塩基配列決定法 ジデオキシ法（サンガー法） 特定塩基のジデオキシリボヌクレオチドを取り込むとDNA合成が終結 ↓ 　　　　　↓ 　　電気泳動でオリゴヌクレオチドの長さ（塩基数）を測定 　　特定塩基までの塩基数から特定塩基の位置を決定 ATGCATGCATGCという配列のオリゴヌクレオチド 　　ddCTPを加えてDNA合成反応を行う 　　　↓ 　　ATGCATGCATGC 塩基数12 　　ATGCATGC 塩基数8 　　ATGC 塩基数4 　　Cは4，8，12番目にある

ハイブリッド形成による遺伝子解析 ハイブリダイゼーション（交雑） 相補的な配列をもつ異種DNA同士で二本鎖を形成させること 　　目的の遺伝子を含む 　　　・プラスミドを保有するコロニー（コロニーハイブリダイゼーション） 　　　・ファージにより形成されたプラーク（プラークハイブリダイゼーション） 　　　・アガロースゲル上の切断DNA（サザンハイブリダイゼーション） 　　　・アガロースゲル上のmRNA（ノーザンハイブリダイゼーション） 　　を検出することができる ウエスタンブロット 　　ポリアクリルアミドゲル上のタンパク質 ← 標識抗体

コロニーハイブリダイゼーション プラークハイブリダイゼーション ライブラリー遺伝子を含むファージのプラーク ライブラリー遺伝子を含む菌のコロニー ライブラリー遺伝子を含むファージのプラーク ニトロセルロース膜にレプリカ NaOHで変性（一本鎖DNA） 減圧加熱（DNA固定） 目的配列を持つ32P標識DNAと反応 標識されたコロニー（プラーク）から遺伝子を回収

遺伝子変異（改変）と機能解析 人為的に目的の遺伝子を変異させ，その遺伝子機能を解析する 部位指定変異導入 　人為的に目的の遺伝子を変異させ，その遺伝子機能を解析する 部位指定変異導入 　遺伝子内部の目的とする位置に正確に変異を導入し，改変遺伝子を作製する 　　　変異部分を含む遺伝子配列を作製　→　相同組換え トランスジェニック（遺伝子導入）生物 　人為的に遺伝子を導入，置換，欠失させて作製した生物 　（遺伝子）ノックアウト・・・正常遺伝子を欠失または不活性化させること RNAi（RNA干渉）・・・特定にmRNAの働きを抑制　→　遺伝子機能解析 　mRNAの相補鎖（アンチセンス）の導入 　特定のmRNAを分解するリボザイム（酵素活性をもつRNA）の導入 　siRNA・・・21～23塩基対の2本鎖RNA　→　配列特異的にmRNAを切断

DNAマイクロアレイ DNAマイクロアレイ（DNAチップ） mRNAから作製したcDNAを蛍光ラベル ↓ 　　　　　↓ 　　基板に固定した1本鎖DNAとハイブリダイゼーション 　　数千～数十万の遺伝子発現レベルを解析

遺伝子情報と利用

病原微生物の検出と同定 PCR（ポリメラーゼ連鎖反応） 鋳型DNAに対して，特定配列の1本鎖DNAと部分的2本鎖を形成させ， 　　この反応を繰り返すことにより，目的遺伝子を増幅することができる。 　鋳型DNA 　プライマー・・・合成した短鎖DNA 　耐熱性DNAポリメラーゼ（DNA合成速度が速い） 　病原細菌や毒素に特異的なDNAをPCR法により検出することができる　

PCR (Polymerase Chain Reaction) サイクル２ サイクル１ DNA鎖の分離 プライマーの結合 DNA複製

cDNAの調製（RT-PCR） mRNA プライマーの結合 DNAへの逆転写 混成２本鎖 アルカリ処理（mRNAを分解） ＡＡＡＡＡＡ プライマーの結合 ＡＡＡＡＡＡ ＴＴＴＴＴＴ DNAへの逆転写 ＡＡＡＡＡＡ 混成２本鎖 ＴＴＴＴＴＴ アルカリ処理（mRNAを分解） １本鎖 cDNAの3'末端は ヘアピンループを形成 ＴＴＴＴＴＴ DNA複製 ＡＡＡＡＡＡ ＴＴＴＴＴＴ S1ヌクレアーゼ処理 ＡＡＡＡＡＡ ２本鎖 cDNA ＴＴＴＴＴＴ (PCR)

遺伝子解析法 リアルタイムPCR 蛍光色素が結合した短鎖DNAをプローブ（探査針）として用いたPCR 　　プローブまで相補鎖合成が進むと蛍光を発する　→　定量可能 RAPD（Randomly Amplified Polymorphic PCR） 　　ランダムに合成した10塩基程度のプライマーを用いたPCR 　　種の比較などに利用する AP-PCR（Arbitrarily Primed PCR） 　　反応初期の数サイクルの2本鎖形成条件を緩くし， 　　1つのプライマーを用いて染色体中の複数の領域を同時に増幅させるPCR 　　バンドのパターンから遺伝的多型性などを評価できる パルスフィールドゲル電気泳動法 　　数百kb～数Mbの高分子DNAを分離できる

バイオテクノロジーの発展 ポリペプチドは遺伝子工学により作ることができる → バイオ医薬品 バイオ医薬品 　ポリペプチドは遺伝子工学により作ることができる　→　バイオ医薬品 バイオ医薬品 　　遺伝子組換え技術あるいは細胞培養技術を用いて製造された 　　ポリペプチドまたはタンパク質を有効成分とする医薬品 　微生物分野におけるバイオ医薬品 　　　遺伝子組換えワクチン・・・B型肝炎，ヒトパピローマウイルス 　　　抗体・・・抗RSウイルス抗体 遺伝子組換え作物 　　害虫抵抗性遺伝子・・・BTトキシン 　　除草剤耐性遺伝子

代表的なバイオ医薬 医薬 適用 製造法 ペプチドホルモン インスリン 糖尿病 大腸菌 成長ホルモン 小人症 大腸菌 　医薬 適用 製造法 ペプチドホルモン 　インスリン 糖尿病 大腸菌 　成長ホルモン 小人症 大腸菌 　心房性ナトリウム利尿ペプチド 急性心不全 大腸菌 　グルカゴン 低血糖症 酵母 サイトカイン 　インターフェロンα C型肝炎，がん 大腸菌 　インターフェロンγ がん 大腸菌 　インターロイキン２ がん 大腸菌 増殖因子 　エポエチン（エリスロポエチン） 貧血 動物細胞 　G-CSF 白血球減少 大腸菌

代表的なバイオ医薬 医薬 適用 製造法 酵素 t-PA 血栓溶解 動物細胞 エプタコグアルファ（血液凝固第VII因子） 血友病 動物細胞 　医薬 適用 製造法 酵素 　t-PA 血栓溶解 動物細胞 　エプタコグアルファ（血液凝固第VII因子） 血友病 動物細胞 　オクトコグアルファ（血液凝固第VIII因子） 血友病 動物細胞 受容体 　エタネルセプト（TNF-α受容体） 関節リウマチ 動物細胞 ワクチン 　Ｂ型肝炎ワクチン Ｂ型肝炎 酵母 抗体 　トラスツズマブ（ハーセプチン：抗HER2抗体） 乳がん 動物細胞 　リツキシマブ（リツキサン：抗CD20抗体） 悪性リンパ腫 動物細胞 　バシリキシマブ（抗CD25抗体） 腎移植 動物細胞 　インフリキシマブ（抗TNF-α抗体） 関節リウマチ 動物細胞 　パリビズマブ（抗RSウイルス抗体） RSV気道感染症 動物細胞

遺伝子組換えと生物多様性 組換え生物 病原遺伝子，毒素遺伝子などの危険な遺伝子が拡散する可能性 　　病原遺伝子，毒素遺伝子などの危険な遺伝子が拡散する可能性 　　在来生物が駆逐され，生物多様性が損なわれる可能性 物理的封じ込め 　　実験施設の設備，装置による封じ込め　P1～P3 生物学的封じ込め 　　実験に用いる生物の環境における生存能力に関する規制 　　　B1　Escherichia coli K12など 　　　B2　Escherichia coli χ1776など（遺伝的欠陥により特殊培養条件必要） カルタヘナ議定書 　　生物多様性に影響する可能性のある組換え生物の取り扱い法を制限