五十嵐研　雑誌会　No. 1112 逆回転β酸化経路による物質生産 平成２４年５月２３日　 石井　正治

微生物による物質生産のためのDriving Force ガス状分子の放出 不可逆的反応あるいはポリマー化反応の　存在 Futile cycleによるATPの消費あるいはATPシンターゼの破壊（ATP生成が関与している場合） 外部sinkへの電子授受 相分離による生産物除去 Appl. Environ. Microbiol., 77(9) 2905-2915 (2011)

β酸化経路 Acetyl-CoA (Cn-2)Acyl-CoA 3-Ketoacyl-CoA (Cn)-Acyl-CoA CoA-SH 3-Ketoacyl-CoA (Cn)-Acyl-CoA FAD β酸化経路 NADH FADH2 NAD+ 3-Hydroxyacyl-CoA Enoyl-CoA H2O

β酸化経路 Acetyl-CoA (Cn-2)Acyl-CoA 3-Ketoacyl-CoA (Cn)-Acyl-CoA CoA-SH Acetyl-CoA acyltransferase fadA 3-Ketoacyl-CoA (Cn)-Acyl-CoA FAD 3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase NADH Acyl-CoA dehydrogenase fadB FADH2 NAD+ fadE 3-Hydroxyacyl-CoA Enoyl-CoA Enoyl-CoA hydratase H2O fadB

逆回転 β酸化経路による 物質生産 Nature 476: 355-361 (2011)

Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase 逆回転 β酸化経路による 物質生産 Thiolase yqeF, fadA, atoB Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase Enoyl-CoA reductase fadB ydiO Enoyl-CoA hydratase fadB Nature 476: 355-361 (2011)

脂肪酸生合成経路と逆回転 β-酸化経路の比較 n/4 C6H12O6 + ATP → CnH2n+2O + n/2 CO2 + (n/2 -1) H2O n/4 C6H12O6 → CnH2n+2O + n/2 CO2 + (n/2-1) H2O + n/2 ATP

使用菌株の特徴 １．大腸菌のβ酸化系が含まれている、fadとatoレギュロンのconstitutiveな発現 　　　fadRとatoC(c) への変異 ２．CRP-cAMP複合体によるカタボライト抑制の回避 　　　CrpのcAMP-independent mutant（crp*）の使用 ３．β酸化系酵素遺伝子のArcAによる抑制回避 　　　arcA遺伝子除去 RB01: MG1655 fadR atoC(c) crp* ΔarcA RB02: MG1655 fadR atoC(c) crp* ΔarcA ΔadhE Δpta ΔfrdA

ブタノール生産性 AtoB: acyltransferase specific to short chain acyl-CoA molecules YqeF: predicted acyltransferase YqhD: aldehyde/alcohol dehydrogenase FucO: 1,2-propanediol oxidoreductase EutE: Aldehyde dehydrogenase with high sequence similarlity to AdhE and YqhD

リアクターを用いてのブタノール生産 14 g/L, 0.33 g/g-Glucose consumed, 2 g Butanol/g-cell dry weight/h 消費グルコース当たりの モル収率：８４．５％ 73.4 mmol Acetyl-CoA/g-cell dry weight/h (12-18h)

既往研究との比較

一寸、待った！！

この反応は不可逆！！ β酸化経路 Acetyl-CoA (Cn-2)Acyl-CoA 3-Ketoacyl-CoA CoA-SH Acetyl-CoA acyltransferase fadA 3-Ketoacyl-CoA (Cn)-Acyl-CoA この反応は不可逆！！ FAD 3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase NADH Acyl-CoA dehydrogenase fadB FADH2 NAD+ fadE 3-Hydroxyacyl-CoA Enoyl-CoA Enoyl-CoA hydratase H2O fadB

個々の反応に関わる酵素タンパク （此処に至る詳細は不明ではあるが・・） Reaction (1): Acetyltransferase YqeF Reaction (2) and (3): 3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase and Enoyl-CoA hydratase FadB Reaction (4): Acyl-CoA dehydrogenase/ Enoyl-CoA reductase YdiO Reaction (5): Aldehyde-forming acyl-CoA reductase MhpF Reaction (6): Butanol dehydrogenase FucO

FadA + YqeF由来の活性 YqeF増幅効果 FadAの寄与 FadA + YqeFの寄与

個々の反応に関わる酵素タンパク （此処に至る詳細は不明ではあるが・・） Reaction (1): Acetyltransferase YqeF Reaction (2) and (3): 3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase and Enoyl-CoA hydratase FadB Reaction (4): Acyl-CoA dehydrogenase/ Enoyl-CoA reductase YdiO Reaction (5): Aldehyde-forming acyl-CoA reductase MhpF Reaction (6): Butanol dehydrogenase FucO

YdiOの周辺を見てみると・・ ydiO: predicted acyl-CoA dehydrogenase ydiF: fused predicted acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase: alpha subunit/beta subunit ydiP: predicted DNA-binding transcriptional regulator ydiQ: predicted electron transfer flavoprotein subunit ydiR: predicted electron transfer flavoprotein, FAD-binding subunit ydiS: predicted oxidoreductase with FAD/NAD(P)-binding domain ydiT: predicted 3Fe-4S ferredoxin-type protein fadK: short chain acyl-CoA synthetase, anaerobic http://mbgd.genome.ad.jp/htbin/MBGD_gene_info_frame.pl?name=eco:B1695

　　　　　　　　熱力学的解析

疑問点 ○著者らは、Acyl-CoA dehydrogenaseが不可逆であることは認識している筈だ。 ○Enoyl-CoA reductaseを発現させないと、逆回転しないことも承知していた筈だ。 ○しかし、当初、YdiOの発現は特に狙ってはいないようだ。 ○YdiOのことを理解した上で、過剰発現は特に狙わなかったのだろうか？ ○何故、ｆadE （逆方向の酵素をコードする遺伝子） を破壊しないのだろうか？ ○Enoyl-CoAは大腸菌に悪影響を及ぼすのだろうか？

Thioesterase-driven reaction 逆回転 β酸化経路による 物質生産 Thioesterase-driven reaction Nature 476: 355-361 (2011)

１回転で生成され得る他の物質の生産性 生産性の低さ ⇔ Driving Forceの欠如 TesA: Thioesterase I TesB: Thioesterase II エノイル-CoAの毒性を示唆？ 生産性の低さ　⇔ Driving Forceの欠如　

複数回の回転では？ fadD: Acyl-CoA synthetase （欠損させることで脂肪酸の再吸収を防ぐ） 使用菌株：RB03 (RB02 [fadBA+] ΔyqhD ΔfucO ΔfadD) fadD: Acyl-CoA synthetase （欠損させることで脂肪酸の再吸収を防ぐ）

総括 ○サイクルの利用：還元的TCAサイクルやカルビンベンソンサイクルも、ものつくりのプラットフォームになり得るだろう ○Driving Forceを巧く入れ込むことも重要 ○フラックスが大きい部分を利用することが根本的に重要 ○ものつくりの基盤情報として、フラックス解析を行うことが重要 ○紹介した論文には、多分に幸運が関わっていた？ ○そうでないならば、著者らは、文書化していないデータに基づいた実験デザインを行っている筈だ・・。