カンキツ果実に含まれる蛍光物質の特定 共同研究機関:東北大学,愛媛大学.

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カンキツ果実に含まれる蛍光物質の特定 共同研究機関:東北大学,愛媛大学

背景 カンキツ果皮の蛍光物質の特定 腐敗部に紫外線を照射すると蛍光反応を示す 選果場での検査作業 1次選別 糖度測定 外観測定 2次選別 腐敗,日焼け,傷などの検査 糖度,酸味などを測定 傷,形状などを測定 箱詰め前の最終検査 現在、カンキツの選果場では品質向上のためにTVカメラや、X線による選別を行っています。しかし、それを使用してもこのようなカンキツの腐敗部このように正常部と同系色有しているため特定は難しく、1次選別、さらに2時選別において、人間の手が必要となっております。そこで、腐敗部に紫外選を当てると蛍光反応、明るく光る特性を利用して、紫外LEDによる腐カンキツの検出を目的とします。 Rotten part Normal part 腐敗部に紫外線を照射すると蛍光反応を示す Fig. Rotten orange カンキツ果皮の蛍光物質の特定

実験Ⅰ ミカンの蛍光物質の分析 蛍光物質の抽出方法 物質の抽出 減圧濃縮 液液分配 液体クロマトグラフィー 薄層クロマトグラフィー サンプル 実験Ⅰ ミカンの蛍光物質の分析 蛍光物質の抽出方法 ヘキサン 供試材料 エバポレーター サンプル 分液ロート 温州ミカン南柑20号の果皮(フラベド層も含む)1kg まず、各蛍光成分の蛍光と励起波長を調べるためにミカンの果皮の蛍光物質の分析を行いました。まず腐敗部と、正常部の蛍光成分を調べたところ、同じであることがわかりました。よってミカンの果皮を細かく粉砕し、ヘキサンで抽出し。この時に測定した蛍光スペクトルを指標とし、以下の手順で分離を行い、サンプルを抽出します. 果皮 提供 EYELA 提供 アズワン株式会社 果皮の粉砕 物質の抽出 減圧濃縮 液液分配 吸着剤 シリカゲルを詰める ガラスカラム 抽出液 メタノール層について分離 提供 アズワン株式会社 溶媒 液体クロマトグラフィー 薄層クロマトグラフィー サンプル

Fig. Sinenstein (left) and tageretin (right) 蛍光物質の解析結果 NMR解析結果より,フラボノイドで糖がなく、メチルエーテル化されている可能性がある. ミカンの蛍光物質は複数である. シネセチン,タンゲレチン,ノビレチン,ヘプタメトキシフラボンの可能性がある. Relative intensity Methyl ether group Aromatic ring ・このサンプルを元に物質の構造が推定できるNMR測定によって解析を行いました。芳香環、メチルエーテル基のところに高い強度を示しました。この結果より、フラボノイドで糖がなく、メチルエーテル化されている可能性があります.またミカンの蛍光物質は複数あることがわかりました.そこで文献などより調べた結果シネセチン,タンゲレチン,ノビレチン,ヘプタメトキシフラボンの可能性があります。今回はこの3つの混合液を使用し、サンプルと同定を行いました。まだ、完全には一致しませんでした。今後、さらに分離を行い、NMR,HPLC測定などを行えば特定できると思われます・ 混合液とサンプルを同定 Chemical sift Fig. NMR spectrum OMe H OMe H O C H Me = CH3 Fig. Benzene (left) and methyl ether (middle) and flavonoid (right) Fig. Sinenstein (left) and tageretin (right)

実験Ⅱ 腐敗部位検出実験 蛍光成分全体での励起,蛍光スペクトル Fig. Fluoresce spectrum 実験Ⅱ 腐敗部位検出実験 蛍光成分全体での励起,蛍光スペクトル Peak Effective area ・今回は先程の蛍光成分全体のスペクトルを元に紫外LEDの選択を行いました.蛍光スペクトルの測定結果よりミカンの蛍光長波は500~600nmの間にあることがわかりました。今回このピーク波長530nm付近の励起波長を測定した結果、この図のようなスペクトルを示しました。この結果よりこの部分が当てることが535nmの光を出すには最も有効であると思われます。検査の供試材料として、愛媛の代表果実であるミカン、イヨカン、そのほかに一般的に市場に出回っているカンキツを使用しました。 Fig. Fluoresce spectrum Fig. Excitation spectrum

ミカン果皮より抽出されたサンプル(3-2)中に含まれる分子の分子量をMSで測定し、 <目的> ミカン果皮より抽出されたサンプル(3-2)中に含まれる分子の分子量をMSで測定し、 推測される構造と比較することで、蛍光物質の分子式を決定する。 NMRの結果からサンプル中に含まれる蛍光物質は、 Nobiletin,Tangeretin,Sinesetin,Heptamethoxyflavoneの いずれかであることが推測されている。(山本君卒論より) 各分子の構造、及び分子量は以下の通りである。 Tangeretin 372.373 Sinesetin 372.373 3,5,6,7,8,3’,4’- Heptamethoxyflavone 432.425 Nobiletin 402.399 その他の構造異性体あり

サンプル3-2及び、標品(Nobiletin,Tangeretin)について質量分析を行った <試薬> ・サンプル3-2 ・Nobiletin(Wako 149-07521) ・Tangeretin(Wako 208-15671) ・蒸留メタノール(溶媒) <装置> Applied Biosystems社製 API 2000 LC/MS/MS ・四重極型 ・イオン化法:ESI法

<測定結果-Blank(MeOH)> ブランクに多くのピークが現れた→装置の汚れが原因? この結果よりサンプルは250~500amuの範囲(赤枠内)について測定を行うこととした。

<測定結果-Tangeretin(標品)> (プロトン分,分子量が大きく観測されている)

<測定結果-Nobiletin(標品)>

Tangeretin,Nobiletinのピークはほとんど見られない。 433.2のHeptamethoxyfavoneのピークが見られる。 <測定結果-sample> Heptamethoxyfavone Blank由来 パルミトイル酸? Nobiletin Tangeretin Tangeretin,Nobiletinのピークはほとんど見られない。 433.2のHeptamethoxyfavoneのピークが見られる。 257.0が主ピークになっているが、これはパルミトイル酸かもしれない。(パルミトイル酸は蛍光を持たない)

まとめ ・サンプル(3-2)、および標品(Tangeretin,Nobiletin)のMSを測定した。 →標品で理論的なピークと実測したピークが一致した。 →サンプルでは、Tangeretin,Nobiletinのピークはほとんど観られなかった。 →サンプルでは、433.2の位置にピークが観れらた。 この分子量はHeptamethoxyflavoneと一致する。 →サンプルで、257の位置にピークが観られたが、これはパルミトイル酸かもし れない。パルミトイル酸は蛍光を持たない。 ・蛍光物質の同定 →今回の測定から、蛍光物質の正体は4つの候補の内、 Heptamethoxyfavoneであ る可能性が高い。蛍光物質の同定のためには、 Heptamethoxyfavoneの純 品を用意し、その励起波長及び蛍光波長を測り、ミカンのものと一致するか 確かめるのが、最も簡単な方法であると考えられる。 → Heptamethoxyfavoneには構造異性体が存在する。 Heptamethoxyfavoneの詳し い構造まで決めるためにはサンプルの精製度をあげてNMRなどを測定しな おす必要がある。今回の実験にあたり、参考にした文献では3,5,6,7,8,3’,4’- Heptamethoxyflavoneの存在が報告されている。

参考文献 1:J. Agric. Food Chem. 1987, 35, 525-529 参考: Heptamethoxyfavoneの構造異性体 3,3′,4′,5,5′,7,8‐Heptamethoxyflavone 3,3′,4′,5,5′,6,7‐Heptamethoxyflavone 3,5,6,7,8,3′,4′‐Heptamethoxyflavone 5,6,7,8,3′,4′,5′‐Heptamethoxyflavone 2′,3′,4′,5,5′,6,7‐Heptamethoxyflavone 2′,3′,4′,5,5′,7,8‐Heptamethoxyflavone