シミュレーション演習 狙い 初日 イントロ 2日目 プローブと信号 3日目 実験結果からの数理モデル作成 2019/5/3 シミュレーション演習　狙い 初日　イントロ 2日目　プローブと信号 3日目　実験結果からの数理モデル作成 4日目　時間パターンに対する選択的応答 5日目　スイッチ応答とメモリ 6日目　振動現象 Hill equation, bistability, hysteresis, Optimal stimulus, step response (low path filter), oscillation/wave, 夏はそれぞれの振る舞いをsimulationと実験それぞれを交えて話をする。

ERKの時間波形が異なるだけで異なる現象を制御 2019/5/3 細胞運命決定機構：増殖と分化のスイッチ 現象を分子に帰着せさることができない！ ERKの時間波形が異なるだけで異なる現象を制御 EGF 　　一過性 ERK 活性化 　　増殖 Time EGF or NGF エンコード デコード NGF 　　持続性 ERK 活性化 　　　分化 具体的に取り上げる現象はPC12細胞における細胞運命決定機構です。 PC12cellにEGF刺激を加えますと一過性ERK, 細胞増殖 NGF,持続性ERK、細胞分化 このようにERKの波形が異なるだけで細胞が増殖したり、分化できたりします。 この問題は、二つに分割できて、EGFとNGFのどういう情報をそれぞれ一過性と一過性および持続性の波形にエンコードするか、もう一つはそれぞれの波形をどうデコードすれば細胞の増殖と分化を誘導できるかです。 私たちはすでにこのエンコードの仕組みについて明らかにしております｡ PC12 cells （precursor of neuron）

RasとRap1によるERK活性の制御 EGF NGF Transient ERK activation Sustained ERK activation We analyzed sig This is a block diagram of ERK signaling network we have stated. It is reported that transient ERK activation is mediated by this Ras pathway, and sustained activation of ERK is mediated by this Rap1 pathway. Therefore, ERK activation can be seen as a sum of these two pathways activities. ERKのエンコードのメカニズムですが、 EGF刺激の場合でもNGF刺激の場合でも、一過性のERK活性化は主にRas経路が一過性に活性化することによって作られ、持続性のERK活性化は主にRap1経路が持続的に活性化することで作られます。右は最終的なモデルですが、このモデルにいたるまでに何度が計測とモデルの修正を繰り返しました。 まずこのRas経路に注目します。 NGF

Rasのシンプルモデル GAPi pR GEFi GEF Ras Rasi GAP 無次元化： 2019/5/3 Rasのシンプルモデル GAPi pR GEFi GEF Ras Rasi GAP ＊ただし[GEFtotal]=[GEF]+[GEFi],[GAPtotal]=[GAP]+[GAPi], [Rastotal]=[Ras]+[Rasi] このモデルは、in silico modelからいったん離れて、ブロックダイアグラムから速いアクティベーションと遅いインヒビションを なるべく簡単に記述したモデルです。 名前が多少変わっているが、 ReceptorがGEFやGAPを活性化する反応は1次反応で近似した。 また、GEFやGAPの酵素反応も1次反応で近似した。 これらの式を元に、無次元化した結果、次の式を得る。 無次元化： pR=[pR]/Kd,　GEF=[GEF]/[GEFtotal], GAP=[GAP]/[GAPtotal], Ras=[Ras]/[Rastotal], Kd=k2/k1=pk4/k3, Ke=k6[GAPtotal]/k5[GEFtotal], s=k6[GAPtotal]

q < 1, GEFが早い（活性化が早い） q > 1, GAPが早い（活性化が遅い） モデル縮約 : Ras のシンプルモデル Rasのシンプルモデル Ras GEF GAP SOS EGFR RasGAP Ras GAPi pR GEFi GEF Rasi GAP GAPとGEFの 相対的な時間差 To cut the long story short, we experimentally found that the transient Ras activation depends on the fast SOS activation and slow RasGAP activation, but not on the receptor internalization nor the negative feedback loop. To understand the mechanism of the transient Ras activation further, we developed the simple model of the Ras systems in the next slide. q < 1, GEFが早い（活性化が早い） q > 1, GAPが早い（活性化が遅い）

q < 1, GEFが早い（活性化が早い） q > 1, GAPが早い（活性化が遅い） モデル縮約 : Ras のシンプルモデル Rasのシンプルモデル Ras GEF GAP GAP GAPとGEFの 相対的な時間差 GEF To cut the long story short, we experimentally found that the transient Ras activation depends on the fast SOS activation and slow RasGAP activation, but not on the receptor internalization nor the negative feedback loop. To understand the mechanism of the transient Ras activation further, we developed the simple model of the Ras systems in the next slide. q < 1, GEFが早い（活性化が早い） q > 1, GAPが早い（活性化が遅い）

Rasのシンプルモデル Rasの複雑モデル Rasのシンプルモデル q < 1: GEF is faster 2019/5/3 Rasのシンプルモデル Rasの複雑モデル q < 1: GEF is faster 　Transient Ras activation 〇 q > 1 : GAP is faster 　Transient Ras activation × This is a kind of theoretical prediction which any biologist never appreciate. Don’t you think so. So what, It is apparent. I can read your mind. So I am going to mesmerize you. Let me make you appreciate in the next slide, one, two, three! X軸に時間、y軸にqを取ったグラフ。 log q>0の領域、すなわち、GEFよりもGAPの方が速い時にはRasはTransientな活性を示さないことが分かる。 左がシンプルモデル、右がインシリコモデルでreceptorのdegradationとnegative feedbackを無くした物。 GAP経路のいくつかのパラメータを変更してqを変化させている。 非常によく一致する。SimpleModelが良い近似を与えることが分かる。 しかし、in-vivoでqを変更することは難しいので、実験的に確かめることができない。 Rasのシンプルモデル q < 1: GEF が早い 　Ras の一過性活性化 〇 q > 1 : GEF が遅い 　Ras の一過性活性化 ×

ランプ刺激：刺激の速度を変えよう 刺激のスピードとqの関係に着目！ ステップ ランプ GAP GEF r: (rate of pR) 2019/5/3 ランプ ランプ刺激：刺激の速度を変えよう 刺激のスピードとqの関係に着目！ ステップ GAP GEF r: (rate of pR) Ras 通常、実験ではいっぺんに刺激を与える。工学分野ではこれをステップ入力という。 対して、一定の傾きを持ってだんだん強くなる入力をランプ入力という。 ランプ入力を入れると、相対的に活性加速度の差が縮まる。結果として、transientな活性化が弱くなると予想される。 先ほどのSimple Rasモデルにランプ刺激を与えると、ピークは低くなり、ピーク位置は後方に移動する。 Ras systemは刺激の傾きを捕らえている。

Rasのシステムは刺激の速度（強度ではない）を捉えていた。 2019/5/3 刺激の速度に対する一過性ERKの応答 EGF 刺激 EGFついて、幾つかの濃度を用いてstep刺激、ramp刺激を行いました。実線がstep刺激、点線がramp刺激を示しています。 In silicoモデルでは、step刺激で見られたinitial　phaseのピークが、ramp刺激の場合には減少またはほとんど見られなくなりました。 In vivo実験での結果、予測どおり、step刺激で見られたinitial phaseのピークはramp刺激では減少することが確認されました。 この結果から､initial phase はGFの濃度上昇のスピードを認識していると考えられます。 生体内では、このようなゆっくり上昇する刺激のほうがむしろ自然であると考えられる。 ERKのtransientな活性化は生体内では観察されない現象かもしれない。 Rasのシステムは刺激の速度（強度ではない）を捉えていた。

速度＝濃度差/時間なので2段階刺激 刺激速度が早い 時間あたりの濃度差 刺激の強度そのものではない 2019/5/3 速度＝濃度差/時間なので2段階刺激 刺激速度が早い 時間あたりの濃度差 刺激の強度そのものではない This also confirmed that the rapid temporal rate of EGF triggered the transient ERK activation and that the transient ERK activation does not depend on the absolute or threshold concentration.

Inactivation is constant 2019/5/3 持続性ERKの活性化 EGF ? NGF ERKの Inactivation is constant

NGFの最終濃度（強度） → 持続性ERKの活性化 2019/5/3 NGF刺激の速度を変えてみると NGF stimulation EGF,NGFの両方について、幾つかの濃度を用いてstep刺激、ramp刺激を行いました。実線がstep刺激、点線がramp刺激を示しています。 In silicoモデルでは、EGF,NGF刺激共に、step刺激で見られたinitial　phaseのピークが、ramp刺激の場合には減少またはほとんど見られなくなりました。一方、NGF刺激で見られるsustained phaseについては、step刺激、ramp刺激ともに刺激濃度に応じてほぼ同様に誘導されました。 これらの予測について、In vivo実験で検証しました。その結果、予測どおり、step刺激で見られたinitial phaseのピークはramp刺激では減少することが確認され、また、sustained phaseについても、刺激濃度に応じて、step rampともに同程度に誘導されることが確認できました。 この結果から､initial phase はGFの濃度上昇のスピードを認識し、sustained phaseはGFの最終濃度を認識していると考えられます。 NGFの最終濃度（強度）　→ 持続性ERKの活性化

Rap1とRasのシンプルモデル Ras：さっきと同じ Rap1 違いはたった一つ SOS GAPi pR GEFi GEF Ras 2019/5/3 Rap1とRasのシンプルモデル 違いはたった一つ Ras：さっきと同じ SOS GAPi pR GEFi GEF Ras Rasi GAP TrkA Ras 刺激依存 RasGAP Rap1 C3G GEFi GEF このモデルは、in silico modelからいったん離れて、ブロックダイアグラムから速いアクティベーションと遅いインヒビションを なるべく簡単に記述したモデルです。 名前が多少変わっているが、 ReceptorがGEFやGAPを活性化する反応は1次反応で近似した。 また、GEFやGAPの酵素反応も1次反応で近似した。 これらの式を元に、無次元化した結果、次の式を得る。 TrkA pR Rap1i Rap1 Rap1 GAP 刺激非依存 (constant) Rap1GAP

2019/5/3 RasとRap1の定常状態 Ras Rap1 We measured the sustained ERK activation at 60 min in response to constant and increasing NGF stimulation in silico. Increasing stimulation is represented as the concentration at 60 min. The constant and increasing NGF stimulation led to the similar sustained ERK activation. 両対数でDose response curveを書いた場合、直線の傾きは反応の次数を表す。 GEFとGAPがどちらも刺激依存的なRasモデルの場合、刺激強度に反応しづらい。特に、刺激が弱い時、刺激強度に関わらず一定値を取る。 GEFのみが刺激依存的なRap1モデルの場合、刺激が弱い時には刺激依存的な応答を示す。

持続性ERKの活性化 複雑モデル 実験結果 ERK: NGF ERK: pTrkA (Rap1) ERK: EGF (Ras) 2019/5/3 持続性ERKの活性化 複雑モデル 実験結果 ERK: pTrkA ERK: pEGFR ERK: NGF (Rap1) ERK: EGF (Ras) EGFまたはNGFで細胞を刺激し、レセプターのリン酸化とERKのリン酸化を30分後に同時に測定し、両対数でプロットした。 明らかに反応次数に差があり、NGF刺激でのsustained ERK activationはRap1,EGFではRasであることを示唆する結果を得た。 このとき、EGFレセプターのdegradationはMG132でブロックしている。 Sosによるネガティブフィードバックの影響は当然入っていると考えられる。 検証すべき課題はたくさんある。

RasとRap1システムの普遍的な特徴 Encoders Growth factors t 速い活性化と遅い不活性化 不活性化が一定 Ras 2019/5/3 RasとRap1システムの普遍的な特徴 Ras Receptor GEF GAP ERK Rap1 Receptor GEF GAP ERK Growth factors t 速い活性化と遅い不活性化 不活性化が一定 Ras Encoders Rap1 t t 持続性のERK活性化についてまとめると、 アダプタータンパクFRS2に対する親和性の違いから、EGF刺激では主にRas経路が使われ、NGF経路では主にRap1経路が使われる。 さらに、Ras経路の定常状態は刺激の濃度に対して感受性が低く、あまり活性化しないが、Rap1経路はほぼ刺激の濃度に比例した活性化を示す。 結果として、EGF刺激では刺激濃度に関わらず持続性の活性化を示さないが、NGF刺激では刺激濃度に依存した持続性の活性化を示す。 １）一過性ピーク：早いスピード 　　（刺激の早い時間成分） Sasagawa, S. et al, Nat. Cell Biol. 2005, 7 (4), 365-373

RasとRap1システムの普遍的な特徴 Encoders Growth factors t 速い活性化と遅い不活性化 不活性化が一定 Ras 2019/5/3 RasとRap1システムの普遍的な特徴 Ras Receptor GEF GAP ERK Rap1 Receptor GEF GAP ERK Growth factors t 速い活性化と遅い不活性化 不活性化が一定 Ras Encoders Rap1 t t 持続性のERK活性化についてまとめると、 アダプタータンパクFRS2に対する親和性の違いから、EGF刺激では主にRas経路が使われ、NGF経路では主にRap1経路が使われる。 さらに、Ras経路の定常状態は刺激の濃度に対して感受性が低く、あまり活性化しないが、Rap1経路はほぼ刺激の濃度に比例した活性化を示す。 結果として、EGF刺激では刺激濃度に関わらず持続性の活性化を示さないが、NGF刺激では刺激濃度に依存した持続性の活性化を示す。 １）一過性ピーク：早いスピード 　　（刺激の早い時間成分） ２）持続性活性化： 　　　刺激の強さによらない Sasagawa, S. et al, Nat. Cell Biol. 2005, 7 (4), 365-373

RasとRap1システムの普遍的な特徴 Encoders Growth factors t 速い活性化と遅い不活性化 不活性化が一定 Ras 2019/5/3 RasとRap1システムの普遍的な特徴 Ras Receptor GEF GAP ERK Rap1 Receptor GEF GAP ERK Growth factors t 速い活性化と遅い不活性化 不活性化が一定 Ras Encoders Rap1 t t 持続性のERK活性化についてまとめると、 アダプタータンパクFRS2に対する親和性の違いから、EGF刺激では主にRas経路が使われ、NGF経路では主にRap1経路が使われる。 さらに、Ras経路の定常状態は刺激の濃度に対して感受性が低く、あまり活性化しないが、Rap1経路はほぼ刺激の濃度に比例した活性化を示す。 結果として、EGF刺激では刺激濃度に関わらず持続性の活性化を示さないが、NGF刺激では刺激濃度に依存した持続性の活性化を示す。 １）一過性ピーク：早いスピード 　　（刺激の早い時間成分） ２）持続性活性化： 　　　刺激の強さによらない １）持続性活性化：刺激の強さ 　（刺激の遅い時間成分） Sasagawa, S. et al, Nat. Cell Biol. 2005, 7 (4), 365-373

不活性化の違いが微分回路と積分回路を生み出す！ 2019/5/3 不活性化の違いが微分回路と積分回路を生み出す！ Rap1 Receptor GEF GAP ERK Ras Receptor GEF GAP ERK Growth factors t 不活性化が一定 速い活性化と遅い不活性化 Encoders ERK ERK t t 一過性ピーク：速いスピード 持続性活性化：刺激の強さ その結果、一過性のERKの活性化は早い活性化と遅い不活性化からなる経路により制御されていて、刺激のスピードに反応する。 一方、持続性ERKの活性化は、不活性化が一定の経路により制御されていて、刺激の強さを捕らえることを明らかにしました。 これらは刺激のスピードと強さという一見別々の物理情報を捕らえていると思っていました。 しかし、論文を出した後で、よくよく見てみると、こちらは刺激が早くないとだめ、こちらは刺激が遅くないとダメということから、周波数特性、時間情報コーディングの観点から統一的に説明できるのではないかと思いました。これが今回の計画の出発点です。 高周波成分：速くないとダメ （微分回路） 低周波成分：遅くないとダメ （漏れ積分回路）

つまり、入力シグナルの時間波形(周波数）をsignaling networksがフィルタしている！ 2019/5/3 時間パターンによる選択的制御 ステップ t パルス 速い時間成分 t ランプ 遅い時間成分 t 刺激 速い、遅い時間成分 Ras-like system (微分回路、 高周波フィルタ？） t Rap1-like system (積分回路、 低周波フィルタ？） t 刺激パターン　Ｘ　分子ネットワーク　＝　反応 つまり、入力シグナルの時間波形(周波数）をsignaling networksがフィルタしている！ Matlab demo

人間の感覚も変化を捉えれて適応する 視覚、嗅覚などは刺激の「変化」をとらえる 早い興奮系と遅い抑制系からなる一過的変化 固視微動 2019/5/3 人間の感覚も変化を捉えれて適応する 視覚、嗅覚などは刺激の「変化」をとらえる 早い興奮系と遅い抑制系からなる一過的変化 固視微動

2019/5/3 末梢感覚ニューロン 22 22

2019/5/3 固視微動 固視微動 23 23

静止網膜像 固視微動がなくなると見えなくなる 2019/5/3 静止網膜像 固視微動がなくなると見えなくなる 静止網膜像 24 24

静止網膜像 固視微動がなくなると見えなくなる 2019/5/3 静止網膜像 固視微動がなくなると見えなくなる 静止網膜像 25 25

静止網膜像 固視微動がなくなると見えなくなる 2019/5/3 静止網膜像 固視微動がなくなると見えなくなる 26 26

分子は媒体 TAKE HOME MESSAGE 分子は媒体。 この研究での背後にある概念的なものがテークホームメッセージです。 2019/5/3 TAKE HOME MESSAGE 分子は媒体 分子は媒体。 この研究での背後にある概念的なものがテークホームメッセージです。 AktやERKはみなさんに直接関係ないかも。でも、分子は媒体というメッセージはきっと皆さんにも関係があると思いますのでそれを説明したいと思います。 それに気付くと、分子メカニズムが以前とは違ってみる見える、その引き返せない楔みないな感じを皆さんにも持ってもらえればと思います 27

分子(ERK) → 機能（細胞増殖） ERK経路の役割 細胞増殖 細胞分化 細胞死 細胞周期 記憶学習。 分子と機能をついつい 2019/5/3 分子(ERK) → 機能（細胞増殖） ERK経路の役割 細胞増殖 細胞分化 細胞死 細胞周期 記憶学習。 刺激 時間 Encoder シグナル 分子活性 Decoder1 Decoder2 Akt経路は細胞成長を制御しています。それ以外にもさまざまな機能を制御しています。 このように生命科学においては、分子と機能をついつい対応させてしまいます。でも、これって実は変なことなんです。 ON ON OFF 分子と機能をついつい 対応させたくなるけど、、 OFF gene A gene B gene A gene B 増殖 分化 28

分子自体は情報ではない！ 分子は媒体 分子やネットワークは媒体 →情報を伝えるもの 分子の「変動パターン」が情報 2019/5/3 分子自体は情報ではない！ 分子は媒体 電磁波 周波数、振幅 空気振動 音楽、ニュース 分子やネットワークは媒体 →情報を伝えるもの 分子の「変動パターン」が情報 　→分子ネットワークの上を伝わるもの 成長因子 時間波形 細胞増殖 シグナル分子波形 細胞分化 結論から言いますと分子自体は情報でも機能でもありません。分子は媒体です。 意外に思われるかもしれませんが、まずはラジオを例にとって説明しましょう。 したがって、分子あるいは分子ネットワークは媒体で、情報はそのネットワーク上を伝わるもの、分子の変動パターンが情報だということがわかります。この概念をここでは時間情報コーディングと呼んでいます。 29