（古林コメント） macで保存したのでタイトルの位置などがズレてますが他は問題ありません． 枚数が多かったのでいくつかはアニメ化しました． 豊田より ストーリーは是非アニメーションにしていましましょう。 全体の色調は、深青－緑系できれいだと思います。WEB色調でいえば、アクセント色はオレンジですね。背景は白地のままかな？

物語 豊田より ここでは、毬藻とは何かを説明しなきゃいけません。毬藻の生態についてCMをつくる気持ちで。かわいらしい毬藻のキャラクターが欲しいところです。日本というオリジナリティをうまく利用することも大事です。 私達の考える物語は大腸菌をマリモのように球体に集合させることです。 社団法人　農林水産技術情報協会 http://www.afftis.or.jp/index.html MARIMO

豊田より ここで、”Bacteria（単細胞生物） vs 藻（群生生物）”なのか、”Bacteria 合体ロボ！”なのか、”Marimoができるのはとても不思議、だから創って理解する”なのか。。。何でもいいのですが、。とにかく「起承転結」の「起承」をしっかり作りましょう。でないと、聴衆は（iGEMersは君達と一緒で、特に）疲れているので寝てしまいます。

私たちのプロジェクトに必要なもの ●大腸菌同士の吸着 →鞭毛にヒスタグを挿入 ●大腸菌の一か所への集合 →クオラムセンシング ●大腸菌の集合体の大きさの制御 →AHLクエンチャー 二種類の大腸菌を設計 豊田より 古林さんはここを２つの項目に纏められるとの意見でしたよね。 タイトルも「私達の着眼点」「私達のアイデア」という感じですね。次のスライドのアニメとかぶせてもいいかもしれません。 大腸菌でマリモをつくるために必要なことを３つ提案しました。１つ目は大腸菌同士の 吸着、２つ目は大腸菌の一か所への集合、３つ目は大腸菌の集合体の大きさの制御 です。１つ目は鞭毛にヒスタグを挿入すること、２つ目はクオラムセンシング、３つ目は AHLクエンチャーを考えました。その結果、AHLSender、AHLReceiverの２つの大腸菌を 設計することに至りました。

DESIGN Receiver Sender 豊田より 回路を入れることで理解しやすくなるかと思ったのですが、ちょっと口で説明するのがもたついてましたので、回路は削って元の通りでいきましょう。よりシンプルにこの４枚のスライドはアニメで纏めましょう。 下部にある言葉は削る、もしくは単語のみで。 Senderは①常にAHLを生産する、また②常にヒスタグ付きの鞭毛を生やすように設計し ました。 Senderは常にヒスタグ付きの鞭毛が生えているのでニッケルイオンを仲介して 大腸菌同士が吸着します。 Senderは常にヒスタグ付きの鞭毛が生えているのでニッケルイオンを仲介して大腸菌同士が吸着します。 Senderは常にAHLを生産します。

DESIGN Senderが生産したAHLが届く範囲にいるReceiverはGFPを発現し、ヒスタグ付きの鞭毛を生やします。 Receiverは①常にaiiAを発言する、② AHL存在下でGFPを発現する、③ AHL存在下でヒ スタグ付きの鞭毛を生やすように設計しました。 Senderが生産したAHLが届く範囲にい るReceiverはGFPを発現し、ヒスタグ付きの鞭毛を生やします。 Senderが生産したAHLが届く範囲にいるReceiverはGFPを発現し、ヒスタグ付きの鞭毛を生やします。

DESIGN ヒスタグ付きの鞭毛が生えたReceiverはニッケルイオンを仲介としてSenderの周りに吸着します。

DESIGN ReceiverはaiiAを発現してAHLを分解します。 AHLが届く範囲が狭まり、鞭毛が生えるReceiverの数が制限され大腸菌の集合体の大 きさが制限されます。 ReceiverはaiiAを発現してAHLを分解します。 AHLが届く範囲が狭まり、鞭毛が生えるReceiverの数が制限され大腸菌の集合体の大きさが制限されます。

豊田より ここで、Designの小まとめとして、遺伝子回路を説明しましょう。そして、AHL, His-tag鞭毛, 金属イオン, aiiAについて簡単にまとめましょう。

豊田より ここで、発表の目次を入れるのを検討してもらえますか？見せる（魅せる）実験データの比重にも寄りますが、とりあえず目次を入れるとメリハリがつきます。

S-adenosyl methionine Quorum Sensing methionine S-adenosyl methionine 3OC6HSL(AHL) metK LuxI LuxI pTet Sender AHL 豊田より ここのアニメはだいぶわかりやすいですが、いろんな説明が混ざってしまっていますので、ちゃんと順序をつけて話しをして、図の配置を決めましょう。（左→右、上→下の配置の法則） それから、遺伝子回路はこのスライドに必要ですか？ LuxR GFP pTet pLux Receiver Quorum sensingを利用するので、その機構を知ることから始めた。Quorum SensingではAHLの濃度によって細胞の数をE.coliが感知するというものである。AHLはmethionineからmetKという酵素で合成されるS-adenosyl methionineをLuxIとacyl-ACPによってAHLは合成される。合成されたAHLは二重膜を通り抜け、拡散していく。これがsender内で行われていることである。 AHLの受け手であるReceiverの二重膜内に取り込まれていく。 Receiver内で発現されているLuxRと結合し、AHLの濃度がある一定値を超えると、Lux promoterを活性化する。 LuxR LuxR 11

AHL quencher ～aiiA～ AHL Sender LuxI 豊田より pTet Sender 豊田より ここも、遺伝子回路がこのスライドに必要なのかが気になります。 AHL aiiA P cons. このMarimo ProjectはAHLの濃度勾配を利用したシステムであるために、際限なくAHLが合成され拡散されないようにする必要がある。そのためには、SenderがAHLを合成するのをやめるか、または合成されたAHL濃度を下げることができればいい。自分たちは、aiiAというAHL分解酵素を利用してAHL濃度を下げることにした。 aiiAはAHLのラクトン環を開裂させることで、AHLのsignal分子としての機能を阻害するものである。 Lacton circle 12

aiiA inverter Receiver LuxR GFP aiiA pTet pLux cI inverter 豊田より むしろ、ここはDesignの図をもってきて、どうやったら濃度感知を鋭敏にするか、というアイデアだよね。 だから、実験のデータの重み（どのくらいのデータが示せるのか）があまりないことも含めて、このスライドは後ろに回したほうがいいと思います。 Low AHL conc. High AHL conc. AHLはSenderから離れるほど濃度がだんだん薄くなっていく。aiiAのまえにインバーターをつけた遺伝子回路であればAHL濃度が薄いときには、aiiAが発現しAHLを分解する。しかし、AHLがある一定の濃度を超えるとcIが発現され、cIプロモーターを抑制してaiiAの発現を止めるようになる。つまり、AHL濃度が高い低いでの差がはっきりするようになる。 このレシーバーによってprojectの目的であるMarimoにはっきりした輪郭つくれるのではないかと考えた。そのために、Biobrickをつなげてこの遺伝子回路を作ることにした。 13

Senderの数とGFP発現 LuxI Sender Receiver LuxR GFP 豊田より pTet Sender Receiver LuxR GFP pTet pLux 豊田より ここは、回路は不要で、次のスライドと一緒にして、実験方法と結果をそれぞれ１枚ずつにすべきだと思う。 Receiver Sender(BW25113 or XL10G), Methionine (10mM or 0mM) Sender:5×10^8～5×10 ProjectであるMarimoはSenderが核となってその周りにReceiverが取り巻くという構造である。 その構造のためには、核となるSenderがどれだけ必要なのかを知っておく必要がある。また、使用する株によっての違いや、代謝経路にあるMethionineが多く入ることによってどのような違いが出るのかを実験し、調べることにした。 AHL Receicerとして図の遺伝子回路を持つものを用意し、どの試験管にも同じ量加えた。SenderはK-12株とXL10Goldを比較してみることにした。さらにMethionineを加えるか加えないかによってどのような差が出るのかも見てみた。 14

Senderの数とGFP発現 Sender:5×10^8～5×10 methionine S-adenosyl methionine 3OC6HSL(AHL) metK LuxI Receiver Sender(BW25113 or XL10G), Methionine (10mM or 0mM) Sender:5×10^8～5×10 その結果、表にあるとおりK-12かぶとXL10GではK-12が確実に多くのAHLを合成している。これには、代謝経路中のmetKの活性が関係しているのではないかと考えられる。また、Methionineの有無によって大きな違いが出ないことから、細胞内でS-adenosyl Methionineは十分量合成されていて、２段階目のLuxIの活性によってAHL合成量が決まるとも考えられる。 Methionine 0mM Methionine 10mM BW25113 5×10^4 XL10G 5×10^7 15

AHL synthesis AHL synthesis 豊田より S-adenosyl methionine methionine metK AHL synthesis LuxI, acyl-ACP 3OC6HSL 豊田より これって、実験結果を受けた考察でつかうスライドだよね。下部の試験管が、意味不明で。。。 Receiver Sender(BW25113 or XL10G), Methionine (10mM or 0mM) Sender:5×10^8～5×10 （このスライドはファイル内にはあったのですがプレゼンでは出てきてないかもしれません．古林）

sensitive receiver 豊田より これはグラフを示してもいいけど、梅野さんが言っていたように、余計なデータもあるし不備も気になるから、回路を示して、絵で表現しましょう。グラフも絵としてしまえば、フリーハンドでいいので。 なぜミュータントをつくろうと思ったか説明する。 ミュータントについて説明、三つ変異だとどうなるか。

sensitive receiver (we made) 豊田より 前の論文を踏まえて、３つ変異を作ろうとしたけど、（手間、金銭、ハンドリングとかの理由で）２つ変異にトライした、とか説明が必要です。それから、実験方法を説明しましょう。 なぜ三つ変異じゃなくて二つ変異にしたか説明。

sensitive receiver (we made) 豊田より 実験結果と考察を説明できるように。 NG, OKはデータを見せないと聴衆は納得できません。 なぜ二つ変異だとダメか説明。

sensitive receiver (we made) 最終的に一つ変異にしたことを説明。

sensitive receiver test LuxR first mLuxR second mLuxR 実験条件をつらつらと ・Receiverの量をいくつにしたか　 ・AHLの量をどう増やしていったか 豊田より 実験結果と考察を説明できるように。 NG, OKはデータを見せないと聴衆は納得できません。

豊田より ここに目次を再び。

Flagellin,FliC Flagella Flagellum 豊田より この２枚のスライドは１枚で語れると思います。 E.Coliは5~10本の鞭毛を持つ。一本の鞭毛は細胞膜にくっついている”hook”　と11本の素繊維が束になった、チューブ状のフィラメントからなる。大腸菌FliCの構造はわかっていない。 Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University ナノ生体科学講座　プロトニックナノマシン研究室（難波研究室） http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/labo/09a.html

Flagellin,FliC Salmonella typhimurium 豊田より その上で、サルモネラの鞭毛を参考に、大腸菌のfliCのアミノ酸残基に挿入位置を決めた、という話で。たぶん、サルモネラを知っている聴衆は多くないので、サルモネラは軽い扱いでOKです。よく知っている人があとで質問してくるとは思いますが。 dispensable サルモネラ菌FliCには四つのドメイン？３つのドメイン？なぜか画像によって違う。→論文に二種類あるというデータが。 論文(Ezaki, S. Tsukio, M. Takagi, M. and Imanaka, T :Display of Heterologous Gene Products on the Escherichia coli Cell Surface as Fusion Protein with flagellin.86,No 5, 500-503. 1998)によれば、大腸菌FliCはD1D2という二つの不可変なDomainと、D3という可変Domainから成っていおり、D3domainをコードしている遺伝子(hag)に、ペプチドリンカーをコードする遺伝子を挿入すれば、ペプチドリンカーが発現することが分かっている。このことを元に、FliCの外側にHistidine loop peptideを発現させる遺伝子を挿入しようとした。大腸菌FliCの構造は明らかになっていないため、サルモネラFliCの構造を参照し、挿入する場所を決めた。 ・Flagellin has four domains, D0, D1, D2 and D3. ・D1 and D2 are needed for the formation of the functional flagellar filament. ・D3 does not take part in the formation of flagella. indispensable プロトニックナノマシンプロジェクト, ERATO 研究成果 (1) http://www.npn.jst.go.jp/index_jp.html

FliC-His 豊田より ここは、遺伝子回路をつくる実験方法をちゃんと説明した方がいいのではないでしょうか。 His-Tag Histidine loop peptideを挿入する場所として、５か所候補があった。そのうち、FliC遺伝子の267番目にHistidine loop peptide 遺伝子を挿入。 His-Tag

Beads adsorption 豊田より どうやってFliC-Hisが機能発現しているかをアッセイする方法を説明。 Four of cobalt’s six coordination sites are occupied. ・The imidazole rings of histidine residues are able to occupy the two remaining coordinate sites, resulting in protein binding ・Four of cobalt’s six coordination sites are occupied. ・The imidazole rings of histidine residues are able to occupy the two remaining coordinate sites, resulting in protein binding.

Beads Adsorption 豊田より ここは実験方法と結果を説明するスライドにしなければいけないと思います。 培養液とビーズを懸濁させる。マグネットにつける。上澄みを捨てる。エルーション。 溶液をinculate FliC-Hisを発現していてかつ、BeadsにCo2+イオンがついている場合のみ、コロニーが生える。 その他との比をとると、？？倍程度。 つまり、Histidine-Co2+相互作用が確認できた。ただし、histidineがなくても吸着していることから、Histidine-Co2+ 相互作用以外にも、吸着する要因があるが、その力は弱い。 これにより、FliC-Hisの吸着能力が確認された。

Toxicity-Check Ni2+ Co2+ 豊田より Co2+ :1μM-!? 10μM-!? 100μM-!? 1mM-!? Ni2+ :1μM-!? Ni2+ Co2+ 豊田より これは、以前Niありの培地でリング形成をやっていましたよね。微妙な結果でしたので、ふせておいて、ちゃんとした実験があと１週間で可能であれば、後で追加する。 LBで培養したSenderとReceiverの培養液に、Ni2+イオンとCo2+イオンを加える,respectively. その培養液をinculateする。コロニーチェック。 Sender or Receiveｒ

Sender 豊田より とりあえず、やった実験について方法と結果をのせないと。それまでは、スライドはふせて、取って置きましょう。 AHL ＋ Co2+ aggregated

Receiver aggregation 豊田より とりあえず、やった実験について方法と結果をのせないと。それまでは、スライドはふせて、取って置きましょう。 Sender AHL ＋ Co2+ aggregated

豊田より ここに目次を再び。

Final-Construction SenderはFliCを発現している。AHLを生産している。 ReceiverはAHLを感じてGFPとFliCを発現する。

Final-Construction 実験 鞭毛間吸着テスト 　　　　　　　　　　　（senderとreceiver同士が吸着するか確認） 有限確認テスト Marimo形成テスト 豊田より Final Constructionは、実験データが今のところないので、今の段階ではFuture Workとして、スライドは１，２枚のみで紹介しましょう。 来週発表までに間に合えば、そのときにスライドを追加しましょう。 それと、最後のスライドに謝辞として、スポンサー（会社、千葉大）を載せておきましょう。 最終的なテストとして、次の３つの実験を行う。 １．鞭毛間吸着テスト→senderとreceiver同士がHisタグで吸着するか確認するため ２．マリモ有限確認テスト→マリモを作る前の段階として、マリモの成長が有限の大きさで止まるか２次元で確認するため ３．マリモ形成テスト→ついにマリモを作る

Adsorption Test +imidazole S R R S S R R S Senderとreceiver ばらばらのコロニーができる S R R S S R R S まず、鞭毛間吸着テストを行う。 Senderとreceiverをそれぞれ培養し、receiverの培養液の中に、senderを１滴加える。 その中に金属イオンを加えると、senderとreceiverが鞭毛同士で吸着し始める。 ある程度吸着したら、imidazoleを加えたものとそうでないものをプレートにまく。 imidazoleを加えたものはばらばらのコロニーができ、imidazoleなしのものは、senderとreceiver がくっついているので、くっついたコロニーができる。 以上が示せれば、senderとreceiverがHisタグ同士で吸着していることがわかる。 Senderとreceiverをそれぞれ培養し、receiverにsenderを１滴加える Senderとreceiver くっついたコロニーができる

Adsorption Test 顕微鏡写真 顕微鏡写真 その結果を顕微鏡で写真撮った。 +imidazol Non imidazol

Final-Construction 実験 鞭毛間吸着テスト 　　　　　　　　　　　（senderとreceiver同士が吸着するか確認） 有限確認テスト Marimo形成テスト 次に、マリモの有限確認テストを行う。

有限確認テスト S R R S S R R S Senderとreceiverをそれぞれ培養する Receiverを均一にまく senderとreceiverを試験管でそれぞれ培養する。次にreceiverをプレートに均一にまき、senderを真ん中に少量スポットし一晩培養する。 senderの近く（GFPを発現している)、中間、遠く（GFPを発現していない）から数箇所ずつ菌をとってそれぞれ希釈液を作る。 O/N AHLを感じたreceiverは GFPを発現している Senderからの距離を変えて何箇所 からか菌をとる。

希釈した菌にCo2+を加えてプレートにまく。 Ｃｏ２＋ まく R R R R R R R R R R R R 希釈した菌にCo2+を加えてプレートにまく。 FliCを発現していなかったreceiverは、ばらばらのコロニーを 作る。 FliCを発現していたreceiverは塊になったコロニーを作る。 ＦｌｉＣを発現していない ＦｌｉＣを発現している FliCを発現していなかったreceiverは、ばらばらのコロニーを 作る。 FliCを発現していたreceiverは塊になったコロニーを作る。

Final-Construction 実験 鞭毛間吸着テスト 　　　　　　　　　　　（senderとreceiver同士が吸着するか確認） 有限確認テスト マリモ形成テスト 次に、マリモ形成テストを行う。

How to make Marimo Co2+ S S S R R Receiver R O/N Culture R R R R R R まず、receiverとsenderを一晩培養する。 Receiverの培養液の中にはCo2+をまぜておく。 R Co2+ R R R R R

How to make Marimo Co２＋ S S S R R Receiver AHL R O/N Culture R R R R R 内径１００μmのキャピラリーでsenderを吸い取り、receiverの培養液の中に加える。 AHLはとても小さな分子で、自由度が高いので、拡散するのが早い。 キャピラリーを利用することによって、senderが生産するAHLの拡散を遅くし、AHLの濃度勾配を作ることができる。濃度勾配によって より球体に近いマリモができる。 R Co２＋ R R R R R

How to make Marimo Co2+ S S S R R R R Receiver O/N Culture R AHL S R S Senderの出したAHLが拡散し始める。 S Co2+ R S S R R R

How to make Marimo Co２＋ S S S R Receiver O/N Culture R R R AHL R S S R ReceiverがAHLを感じて鞭毛を生やし、Co２＋を介してHisタグ同士で吸着し始める。 R S Co２＋ S R S R R R R R

How to make Marimo Co2+ S S S R Receiver O/N Culture R R R AHL R S S R ReceiverがGFPを発現する。 R S Co2+ S R S R R R R R

How to make Marimo MARIMO! Co2+ S S S R Receiver O/N Culture R R R AHL 集合が成長してマリモになる。 R S Co2+ S R S R R R R R MARIMO!