Nrf2 links epidermal barrier function with antioxidant defense EMBO Molecular Medicine 2012 Vol.4,364-379 Matthias Schäfer, Hany Farwanah, Ann‐Helen Willrodt, Aaron J. Huebner, Konrad Sandhoff, Dennis Roop, Daniel Hohl, Wilhelm Bloch, Sabine Werner Nrf2 links epidermal barrier function with antioxidant defense Nrf2は抗酸化防御と表皮バリア機能を結びつける 2014/12/22 U4 柴田真衣

Nrf2について 酸化ストレスによって誘導される転写因子、様々な抗酸化物質や解毒酵素の合成を促進し、細胞を保護する役割を持つ。 文部科学省HPより　http://www.tanpaku.org/tp_fundamental_biology/fbb1.php 酸化ストレスによって誘導される転写因子、様々な抗酸化物質や解毒酵素の合成を促進し、細胞を保護する役割を持つ。 定常時はセンサータンパク質のkeap1と複合体を形成し、核移行が抑制されている。 酸化ストレスを受けるとkeap1はNrf2を認識しなくなり、Nrf2は核に移行、標的遺伝子の転写を促進する。

背景と目的 皮膚は人体を保護するバリアとして重要な臓器であり、皮膚を酸化ストレスから保護することは、皮膚の完全性や、バリア機能の維持につながると考えられている。 筆者らは、マウスの表皮に特異的な活性型Nrf2変異体を発現させることにより、ケラチノサイトがUVB由来の酸化ストレスから保護されることを発見した。 また、内因性Nrf2のアクチベーターを用いても同様の効果が見いだせることを確認した。(Schäfer et al,2010) しかし、Nrf2の活性化は、酸化ストレスから細胞を保護するだけではなく、有害な 側面も持ち合わせることが報告されている。 ・様々なガン細胞Nrf2が活性化しており、ガン細胞の増殖促進、アポトーシス抑制、化学物質耐性の増強に関与する(Denicola et al,2011;Hayes&McMahon,2009) ・keap1のkoマウスは、表皮の過角化が起こるだけでなく、食道の過角化による栄養失調により3週間以上生きられない。(Wakabayashi et al,2003) →Nrf2の活性化が皮膚にもたらす影響を詳細に分析し、有害な側面のメカニズムを解明することと、メカニズムの解明によりNrf2アクチベーターの皮膚に対する有益性を確かめることを目的とした。

K5cre-CMVcaNrf2マウスの作成 表皮において特異的にNrf2の過剰発現が起こるダブルトランスジェニックマウス(K5cre-CMVcaNrf2マウス)を作成した エンハンサー 常時活性を持つ変異型Nrf2 転写停止配列 EGFP(蛍光タンパク質)を共発現させるための部位 Cre-レコンビナーゼによって切断される部位 Keratin5は表皮基底層で発現する ＝基底層でCre-レコンビナーゼが発現する →表皮で特異的にcaNrf2の転写が起こる

K5cre-CMVcaNrf2マウスの作成 RPA(RNaseプロテクションアッセイ ) を用いてマウス表皮における標的mRNAの検出、定量を行った tg/wt:K5creのみがトランスジェニックされているマウス (今後Controlとして用いる。) →CMVの導入により、caNrf2の発現量が増加した(約4倍)

K5cre-CMVcaNrf2マウスの作成 マウス背部皮膚におけるNrf2標的遺伝子のmRNA発現量をqRT-PCRで定量した。 (n=3,2) 内部標準：Gapdh →CMVの導入によりNrf2標的遺伝子の発現増加量が大きくなったと考えられる。 Nqo1:Nadphデヒドロゲナーゼキノン1 Gclc:グルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット Gclm:グルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット Srxn:スルフィレドキシン

K5cre-CMVcaNrf2マウスの表現型 トランスジェニックマウスの表現型を観察した。 (左図)tg/tgマウスにおける ・体重の減少(supplement data) また、視覚的な ・小型化 ・皮膚の乾燥 ・毛の消失 ・皮膚の鱗状化 が観察された。 (右図)同じ遺伝子型でも表現型の程度に違いがあるように考えられた。

K5cre-CMVcaNrf2マウスの表現型 SC:角層 HF:毛包 SG:皮脂腺 トランスジェニックマウスの背部皮膚の断面をHE染色し、観察した。 tg/tgマウスにのみ ・表皮肥厚化 ・過角化症 ・皮脂腺、毛包の異常 が認められた。

内因性Nrf2の活性化が表皮に与える影響 K5cre-CMVcaNrf2マウスでは表皮の表現型に異常が認められたが、それがNrf2の過剰発現による現象か確かめるために、内因性Nrf2を活性化させ、遺伝子発現や表現型を比較していく。 DMSOにNrf2アクチベーターを添加したもの：非イオン親水性クリーム＝ 2:1で混合し野生型マウスの背部皮膚に塗布した。(2回/日、P0から10日間) スルフォラファン・・・ブロッコリーに微量含まれる含流化合物 tBHQ(tert-ブチルヒドロキノン)・・・Nrf2-ARE(抗酸化剤応答配列)経路の活性化剤

内因性Nrf2の活性化の表皮に対する影響 A:マウス皮膚のHE染色図 B:マウス背部皮膚のmRNA発現量(qRT-PCR,n=3) →Nrf2アクチベーターの塗布で、表皮の過角化、肥厚化、皮脂腺の拡大が観察された。また、Nrf2のターゲット遺伝子の発現上昇が認められた。

内因性Nrf2の活性化の表皮に対する影響 マウス背部皮膚の生存表皮の厚さを計測した。 C:Nrf2アクチベーターの塗布で、表皮が肥厚することが認められた。 D:Nrf2ノックアウトマウスでは、tBHQによる表皮の肥厚化が認められなかった。 →Nrf2アクチベーターの塗布により、 K5cre-CMVcaNrf2マウスと同様にNrf2が活性化され、表皮の肥厚化が誘導されることが認められた。

マウスの年齢と表現型との相関 SC:角層 HF:毛包 マウス背部皮膚をHE染色 →tg/tgマウスにおいて、P32で認められる表皮の過角化、肥厚化が、6mで若干改善される。これは、caNrf2の発現量と相関する(supplement data)。

表皮の分化マーカーの観察 標的タンパク質:赤 核:青(Hoechst) マウス背部皮膚を免疫染色 Lor:ロリクリン、顆粒層で発現する周辺帯タンパク質 Inv:インボルクリン、有棘層で発現する周辺帯タンパク質

表皮の分化マーカーの観察 →基底層、有棘層、顆粒層の肥厚化が認められたが、各タンパク質は正規分布しており、構造上の異常は認められなかった。 標的タンパク質:赤 核:青(Hoechst) K・・keratin K10:有棘層で発現 K14:基底層で発現 K6:通常表皮では発現していない →基底層、有棘層、顆粒層の肥厚化が認められたが、各タンパク質は正規分布しており、構造上の異常は認められなかった。

表皮における細胞分裂量の測定 BrdU:ブロモデオキシウリジン チミジンのアナログで細胞分裂のS期でDNAに取り込まれる。 tg/tgマウスの細胞分裂の程度を調べるために、 C:マウス腹腔内にBrdUを注入 D:tgマウス由来ケラチノサイト培地にBrdUを添加 2時間後、BrdUを取り込んだ細胞の数を数えた。 →細胞分裂量はtg/tgマウスにおいて有意に増加した。 しかし、ケラチノサイト単体ではこの現象は認められなかった。

表皮におけるアポトーシス量の測定 TUNELアッセイでP32マウス表皮のアポトーシスの度合いを測定 アポトーシス量はtg/tgマウスで減少傾向を示したものの、増殖数と比較するととても小さく 細胞の増加量>アポトーシス量 と考えられる。 →表皮の肥厚化は、細胞分裂の促進によって引き起こされる。

表皮バリア機能の測定 Tewameterで経皮水分蒸散量(TEWL)を測定 →caNrf2によって皮膚のバリア機能が低下する。

炎症と皮膚バリア機能低下との関連性の評価 真皮における炎症に関連する細胞を染色し、数を計測した。 (T細胞・・抗CD3抗体、マスト細胞・・トルイジンブルー、好中球・・抗Ly-6g抗体) →P32tg/tgマウスの真皮において、マスト細胞、好中球の数が有意に増加した。 T細胞においては増加傾向があった。

炎症と皮膚バリア機能低下との関連性の評価 マウス皮膚における炎症性サイトカインを定量した。(n=2,3) →P2.5においてはIL-1β、P32においてはIfnγ、IL-1β,IL-6,Tnf-α,が増加した。 IL-6はケラチノサイトの分裂を促進する(Werner et al,2007) →IL-6の増加が過角化と関連する可能性が示唆された。

炎症と皮膚バリア機能低下との関連性の評価 炎症性サイトカインによって発現量が増加する報告のある(Szabowski et al,2000) 各種ケラチノサイト分裂促進物質を定量した。(P2.5,qRT-PCR) →P32において発現量の増加が認められた。 この炎症のタイムコースが表皮肥厚化と関連する可能性が示唆された。 しかし、P2.5における炎症を示すデータがほとんどないため、炎症はNrf2が直接誘導していないと考えられた。

バリア機能に関連する構造の変化 DJ:デスモソーム TJ:タイトジャンク ション ICS:細胞内 スペース 　　ション ICS:細胞内 　　スペース 電子顕微鏡でケラチノサイトの顆粒層を観察 →P32のtg/tgマウスにおいて、細胞内スペースの拡大が観察された。 しかし、デスモソームの数は変化なし

バリア機能に関連する構造の変化 スルホ-NHS-LC-ビオチン:赤 Hoechst:青 SC:角層 SG:顆粒層 マウス皮膚にスルホ-NHS-LC-ビオチンを真皮内に注入し、拡散が 起こる範囲を測定した。 tg/wt,tg/tgマウス両方において、タイトジャンクションがビオチンの侵入を防ぐことが観察された。 →タイトジャンクションの機能性に大きな差かないことが示唆された。

バリア機能に関連する構造の変化 LB:ラメラ構造 矢印:LBが消失している部分、 または LB周辺の膜構造が消失している部分 電子顕微鏡でP32マウスのケラチノサイトの顆粒層を観察 →tg/tgマウスにおいてLBの形態に異常が起こっていることが観察された。

バリア機能に関連する構造の変化 D:電子顕微鏡でケラチノサイトの角層を観察 →tg/tgマウスではCO中にラメラ構造が存在していること、つまりラメラ構造の分布の異常が認められた。 E: OIL RED O 染色で角層を染色 →脂質の分泌は正常に起こっている、周辺帯は形成されている。 CO:角質細胞　　　　SC:角層　　　　SG:顆粒層

表皮の脂質代謝の変化 F:SC中のコレステロール、遊離脂肪酸、セラミド量 G:HPTLCで脂質を分離、定量した。 →tg/tgマウスにおいてSC中のセラミド重量に増加傾向があった。 また、セラミドの代謝に変化が起こっていることが認められた。

表皮の脂質代謝の変化 qRT-PCRで皮膚におけるElovl発現量を測定(n=2,3) P32において、Elovll1,3,4,6,7の発現量が増加した。 Elovl5については減少した。 →P2.5においてElovlsの発現量増加が認められないため、脂質代謝の異常はNrf2の発現量増加による直接的結果ではないことが示唆された。

角質細胞の観察 電子顕微鏡でP32マウスの表皮上部を観察 CO:角質細胞　　　　SC:角層　　　　SG:顆粒層 Scale bar(白):上図:1µm 下図:0.2µm 電子顕微鏡でP32マウスの表皮上部を観察 →tg/tgマウスにおいて、COの細胞質が半透明であること、COが肥厚化していることが観察された。 肥厚化はP2.5でも認められたため(no data shown)、 Ｎｒｆ２の直接的な作用である可能性がある。

フィラグリンの定性、定量 Filaggrin(フィラグリン):ケラチンの凝集(角化)に必要なタンパク質 ウエスタンブロットで表皮中のフィラグリン量を測定した。 →フィラグリン量は増加しているが、分布に異常は認められなかった。

肥厚化、過角化原因遺伝子の探索 Slpi:KLK7のインヒビター、角層の剥離を阻害する qRT-PCRでtg/tgマウスの皮膚におけるSlpiの発現量を測定した。 tg/tgマウスにおいて、P2.5~6mの すべての群において、Slpiの発現量が増加した。 また、P0.5においても発現量の増加が認められた。(Supplyment data) →初期に発現が上昇していることから、Nrf2の発現上昇が、直接的にSlpiの発現を誘導する可能性が示唆された。

SLPIの過角化に対する影響 電子顕微鏡で角層を観察(左図:角層下部 右図:角層上部) C:角質細胞(基底部から1,2,3…) 　SG:顆粒層　　矢印:コルネオデスモソーム 電子顕微鏡で角層を観察(左図:角層下部　右図:角層上部) tg/tgマウスではコルネオデスモソームが正常に劣化していない。 →Slpiの発現量増加によって過角化が促進されている。

肥厚化、過角化原因遺伝子の探索 Lor:ロリクリン Sprr:スモールリッチプロテイン ともに周辺帯を形成する タンパク質 qRT-PCRでマウス皮膚の周辺帯タンパク質発現量を測定 →tg/tgマウスにおいて、Sprr2dとSprr2hの発現量が増加した。 Sprr2dの増加量は、P32を最大としたのに対して、 Sprr2hの増加量は、P2.5を最大とした。 また、sprr2d、2hの発現量は、P0.5でも増加した。(supplement data) →sprr2d,2hがNrf2の直接なターゲットである可能性が考えられた。

Sprr2sの発現の確認 対Sprr2s抗体を用いて、マウス尾部皮膚を免疫染色 E:表皮　　D:真皮 対Sprr2s抗体を用いて、マウス尾部皮膚を免疫染色 →tg/tgマウスにおいて、表皮のSprr2sの量が上昇していることが確認された。

周辺帯の機械的強度の測定 矢印:正常な角質細胞 三角形:損傷した角質細胞 矢印:正常な角質細胞　 三角形:損傷した角質細胞 P32マウスから分離した角質細胞を超音波で処理し、損傷量の変化を継時的に測定した。 tg/tgマウスの角質細胞は超音波によるダメージを受けやすい →角質細胞の物理的強度に関わる周辺帯に、劣化が起こっている可能性が示唆された。

Nrf2の作用の確認 皮膚における遺伝子発現量をqRT-PCRで定量 A:野生型マウスにtBHQを塗布した (Fig2の実験と同様) tBHQによる内因性Nrf2の活性化によって、野生型マウスにおいてもSlpi,Sprr2hの発現量が上昇することが確認された。 B:tg/tgマウス由来のケラチノサイトを用いてqRT-PCR tg/tgマウスでは、in vitroにおいても、SlpiとSprr2hの発現量が上昇することが確認された。

Nrf2の作用の確認 野生型マウス初代ケラチノサイトを用いて、tBHQによる内因性Nrf2活性化が遺伝子発現にもたらす変化を調べた(qRT-PCR) tBHQ添加によって、SlpiとSprr2dの発現量が濃度依存的に上昇した。 また、Nrf2のノックアウトによって、その現象は認められなくなった。 Sprr2hにおいては、tBHQにより同様の減少が認められたが、Nrf2のノックアウトによってキャンセルされなかった。 →SlpiとSprr2dがNrf2の直接的なターゲットである。

総括 Nrf2の過剰な活性化は、sprr2d(2h)とSlpiを過剰に発現させる。

サプリメントデータ

サプリメントデータ

サプリメントデータ

サプリメントデータ

サプリメントデータ

サプリメントデータ