3班 大石南美 片野瑞樹 佐藤綾香 澤木志歩 増田恵実 松崎光ノ介 吉添愛実 芳野文香 5.遺伝子組み換え実験 3班　　大石南美 　　　　片野瑞樹 　　　　佐藤綾香 　　　　澤木志歩　 　　　　増田恵実 　　　　　松崎光ノ介 　　　　吉添愛実 　　　　芳野文香

目的 GFP遺伝子とアンピシリン耐性遺伝 子を大腸菌に導入することで遺伝 子組換え大腸菌を得る

緑色蛍光タンパク質 (green fluorescent protein/GFP) 北太平洋の冷たい海に住むクラゲ(オワンクラゲ)から見つかった 緑色蛍光タンパク質は生物発光を行うタンパク質「エクオリン(aequorin)」が発する青い光を緑色に変える。 参考：https://pdbj.org/mom/42

pUC119 DNA アンピシリン耐性遺伝子をもつ pUC119 クローニングサイト図 参考：http://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/3319_DS_j.pdf

プラスミドの連結反応 pHSG-GFPrev pUC119 BamHI BamHI 参考：http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/genetech.htm

大腸菌の形質転換 ヒートショック （大腸菌） 参考：http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/genetech.htm

β-ガラクトシダーゼ活性を指標とした挿入断片の有無の検出

白色コロニー形成 青色コロニー形成 生産されない 生産される 形質転換○：lacZが転写されない 形質転換×：lacZが転写される X-gal加水分解 白色コロニー形成 青色コロニー形成 Β－ガラクトシダーゼ 生産されない 生産される lacZの有無 形質転換○：lacZが転写されない 形質転換×：lacZが転写される

組み替えタンパク質の解析 MBLライフサイエンス：http://ruo.mbl.co.jp/bio/support/method/sds-page.html

５．　遺伝子組換え実験

５．１ プラスミドの制限酵素処理と精製 実習書p6参照 試薬名（濃度等） pHSG-GFPrev(0.5mg/ml) ５．１　プラスミドの制限酵素処理と精製　 実習書p6参照 試薬名（濃度等） pHSG-GFPrev(0.5mg/ml) pUC119(0.5mg/ml) 10×B 緩衝液　(0.1M Tris-HCL(pH8.0) - 50 mM MgCl₂-1.0M NaCl-10mM β- メルカプトエタノール) 滅菌水　(Deionized and Distilled Water (DDW)) 制限酵素：BamH1(10 units/μl) PIC　試薬　(フェノール・クロロホルム溶液、Phenol-Isoamylalcohol-Chloroform(24:1:24)) 3M　酢酸ナトリウム(NaOAc,pH 5.5) エタノール 70％エタノール TE(10-1) 緩衝液　[10mM Tris・HCl-1mM EDTA(pH8.0)]

(pHSG-GFPPrev/BamHⅠ) ５．１　プラスミドの制限酵素処理と精製 反応液1 反応液2 (pHSG-GFPPrev/BamHⅠ) (pUC119/BamHⅠ) 10xB 緩衝液 4 μl DDW 30 μl pHSG-GFP (0.5mg/ml) 5 μl - pUC119 (0.5mg/ml) BamHⅠ (10U/μl) 1 μl total 40 μl

５．１　プラスミドの制限酵素処理と精製 実習書p6-8参照

このサンプルをプラスミドの連結反応に用いた。 ５．３　プラスミド連結反応 反応液2から8µlとり、 反応液1のチューブに加えた。 実習書p7(4)-(11)、p8(5.3)参照 このサンプルをプラスミドの連結反応に用いた。

５．４ 大腸菌の形質転換とβ-ガラクトシダーゼ活性による挿入DNA断片含有クローンの選択・組換えGFP生産菌の単離 pUC119 1µgあたりの形質転換体数（形質転換効 率）を算出した。 挿入断片を含むプラスミドの形成効率を算出した。 GFP発現率を算出した。

５．６ プラスミドの制限酵素処理・電気泳動による解析 ５．６　プラスミドの制限酵素処理・電気泳動による解析　 実習書p10-11参照 試薬 容量 DDW 15µl 10xB　緩衝液 2µl プラスミド溶液(pUC-GFP1 または NC) BamHⅠ 10U/µｌ 1µl 計 20µl

５．６ プラスミドの制限酵素処理・電気泳動による解析 ５．６　プラスミドの制限酵素処理・電気泳動による解析　 実習書p10-11参照 試薬等 サンプル＃3 サンプル＃4 未消化pUC-GFP1 2µl - 未消化NC DDW 18µl 5x 色素混合液 5µl 計 25µl

６．組換え蛋白質の解析 実習書p12参照

実験結果

5.2　アガロースゲル電気泳動

５．２ マーカー iの結果 y= -0.0721x + 4.7824に iの結果を代入 したところ、右のような結果になった。

５．４　　　６)、７)、９）　実験結果 pUC119 連結反応終了液 GFP生産コロニー数

５．４ 計算結果 形質転換効率＝x（青いコロニー）/{（2.0×10⁻³μg/1110㎕）×100㎕} ５．４　　計算結果 形質転換効率＝x（青いコロニー）/{（2.0×10⁻³μg/1110㎕）×100㎕} 挿入断片形成効率＝βガラクトシダーゼ活性喪失コロニー数/総コロニー 数 GFP発現率＝GFPを発現するコロニー数/βガラクトシダーゼ活性喪失コロ ニー数

5.6 プラスミドの制限酵素処理・電気泳動による解析 の移動距離

５.６ ｙ＝－0.0649x + 4.7198に x=30 を代入→ ｙ＝2.7728となったので 先ほどの は、593bpとなる。 マーカー ｙ＝－0.0649x + 4.7198に x=30 を代入→　ｙ＝2.7728となったので 先ほどの　　　　は、593bpとなる。

6.2 SDS-PAGEによる菌体全蛋白質の解析 （1回目）

6.2 SDS-PAGEによる菌体全蛋白質の解析（2回目） の移動距離

６．２ ｙ＝－0.0115ｘ + 2.1154に x=55 を代入→ ｙ＝1.4829となったので 先ほどの は、30.4(kDa)となる。 マーカー ｙ＝－0.0115ｘ + 2.1154に x=55 を代入→　ｙ＝1.4829となったので 先ほどの　　　　は、30.4(kDa)となる。

考察

5.2　アガロースゲル電気泳動 夾雑物 ＧＦＰ

5.2 アガロースゲル電気泳動 サンプル3がサンプル1のコントロール サンプル4がサンプル2のコントロール 5.2　アガロースゲル電気泳動 サンプル3がサンプル1のコントロール サンプル4がサンプル2のコントロール 制限酵素処理によってpHSG-GFPrevとpUC119が切断されたことを確認 サンプル1は約600bpにバンドが検出された 　　→BamHＩにより2箇所で切断され、ＧＦＰのバンドが検出された サンプル2はサンプル4に比べて大きいサイズのバンドが検出された 　　→BamHＩにより1箇所で切断されて、スーパーコイルが解けて伸びてい る。ＤＮＡはもともとスーパーコイル状になっているため、見かけ上のサイズ は小さく見える。

5.4 大腸菌の形質転換とβ-ガラクトシダーゼ活性による挿入ＤＮＡ断片含有クローンの選択・組み換えＧＦＰ生産菌の単離 5.4　大腸菌の形質転換とβ-ガラクトシダーゼ活性による挿入ＤＮＡ断片含有クローンの選択・組み換えＧＦＰ生産菌の単離　　 形質転換体数、プラスミドの形成効率、ＧＦＰ発現率 を算出 ＧＦＰ発現率は、ＧＦＰ発現株の種類が2種類と考 えられるので、50％が理想である。今回の実験で は理想値に近い40％前後の値が得られた。 形質転換体数が少ないのは、コンピテントセルに ちゃんと入ってないから？または操作ミス

5.6 プラスミドの制限酵素処理、電気泳動による解析 5.6　プラスミドの制限酵素処理、電気泳動による解析 制限酵素処理できていない ＧＦＰ

5.6 プラスミドの制限酵素処理、電気泳動による解析 5.6　プラスミドの制限酵素処理、電気泳動による解析 サンプル＃2は、制限酵素処理が不十分で、バンドが 複数出てしまった。制限酵素処理されていれば、1箇 所で切断され、スーパーコイルが解けるので、バンド は1箇所に出る。しかし、バンドが複数出たので、制限 酵素処理に失敗したと考えられる。バンドが複数出る のは、スーパーコイルの形状により見かけのサイズに ばらつきがあるため。 BamHＩにより2箇所で切断されてＧＦＰのバンドが検出 された。 Ｉ班のサンプル＃１と＃3はバンドが検出されなかった。 　　　　　↓ 　プラスミドの調製がうまくいってない

6.2　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（1回目）

6.2 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（1回目） バンドが出なかった原因を考察する。 6.2　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（1回目） バンドが出なかった原因を考察する。 終夜培養の際に、試験管の角度が浅かったため、 振とう培養が十分ではなかった。 ボイルした際に、途中で水を継ぎ足したため、沸騰 水の温度が下がってしまった。

6.2　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ(2回目）

6.2 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ(2回目） Gluによってlacオペロンの発現が制御されるため、 Gluの方にはバンドが検出されなかった。 6.2　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ(2回目） Gluによってlacオペロンの発現が制御されるため、 Gluの方にはバンドが検出されなかった。 Ｉ班はバンドが薄い→ＧＦＰ発現菌数が少なかった 可能性がある

今回の実験で得られるアンピシリン耐性の形質転換株の種類とその性質 逆の向き 緑色蛍光を示さない コロニーは白色 正の向き 緑色蛍光を示す コロニーは白色

挿入断片を持つ形質転換株の割合を増やすには コンピテントセルが、輸送や保管条件により効率 が低下している可能性があるので、新しいものを 使う。また、塩化カルシウム法より、塩化ルビジウ ム法で作ったものの法が効率がよいので、塩化ル ビジウム法で作られたコンピテントセルを用いる。 形質転換を行う際の熱処理の条件が影響するの で、温度管理を厳密にする。 大腸菌株によっても形質転換効率が違うので、形 質転換が起こりやすい株を使う。また、使う菌株は なるべく新しいものを用いる。