送受信チーム 冨永将大・川崎浩平・井山佳美

目標: gfp発現のタイミングをコントロール 1時間タイマー 1 hour 5時間タイマー 1 hour 4 hours… Still inactive active

細胞間コミュニケーション シグナル分子の蓄積 クオラムセンシング 3

クオラムセンシング 蓄積 pc luxR plux gfp pc AHL Sender cell produce AHL Receiver cell AHL gfp expression pc luxR LuxI 応答閾値を超えるAHLが蓄積されたとき初めて、目的遺伝子の発現がおこる pc luxI LuxR AHL plux gfp 蓄積

AHLの蓄積 通常AHL通信 AHL感受性変更通信 LuxI LuxR ？ LuxR 私たちはこのプロジェクトで蓄積システムを構築します。 In this year, our keyword is accumulation. Many of them are transient and non-traceable. However, their effects are accumulated over time In various scenes, we want to know the total exposure of chemical materials, not its temporal strength. We construct the system that measure the accumulated value of various things. AHL感受性変更通信 ？ LuxR 5

求められること AHLs AHL 感度の異なるAHL受信装置の作成 クロストークの利用 Part:BBa_F2620:Specificity ①AHL合成量、合成速度を下げる→luxIの発現量を小さくする（RBSを替える ②感受性を下げる→シグナル分子を替える ③出力量を下げる→RBSの調整 感度の異なるAHL受信装置の作成 クロストークの利用 Part:BBa_F2620:Specificity http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity

Quorum sensing AHL 基本構造 Autoinducer R:Group Autoinducer synthase 由来生物 Recepter Protein V.Fisheri LuxI LuxR (3OC6) P.aeruginosa lasR lasI (3OC12) P.aeruginosa ＋ RhlI RhlR (C3) (C6) R.leguminosarum cinR cinI (3OH14C)

求められること RhlI RhlI LuxI LasI? CinI? Part:BBa_F2620:Specificity ①AHL合成量、合成速度を下げる→luxIの発現量を小さくする（RBSを替える ②感受性を下げる→シグナル分子を替える ③出力量を下げる→RBSの調整 CinI? Part:BBa_F2620:Specificity http://partsregistry.org/Part:BBa_F2620:Specificity 8

シグナル分子(=AHL)の変更 《クロストーク》 LuxR plux gfp Autoinducer synthase LuxI lasI cinI RhlI

タイムディレイテスト 通信条件 温度 大腸菌株 菌数比 37℃、30℃ JW1908、XL10GOLD Receiver / Sender = 1 10 100

タイムディレイテスト(クロストーク) ? 37℃ or 30℃ gfp LuxR plux Mix(t=0) 蛍光強度測定 Receiver 5×108 Cells Mix(t=0) 蛍光強度測定 37℃ or 30℃ 5×108 Cells ? Senders LuxI lasI RhlI

タイムディレイテスト(Cross-talk) Receiver-JW1908 Senders-XL10Gold ptet LuxR plux gfp plac LuxI plac lasI plac RhlI

cross-talkの効果は？ LasIのみ、delay発生＋低い XL10GOLD , Receiver ： Sender = １ ： １ 37℃ 30℃ LuxI LuxI RhlI RhlI LasI LasI LasIのみ、delay発生＋低い

タイムディレイテスト(TAG効果) ptet LuxR plux gfp plac plac plac plac Senders-XL10Gold Receiver-JW1908 plac LuxI ptet LuxR plux gfp plac LuxI LVA plac RhlI plac RhlI LVA

LVA-Tagの効果は？ LuxI RhlI Tagの効果：最大値の低下 XL10GOLD , Receiver : Sender =1　：　1 (30℃) LuxI RhlI Tagなし Tagなし Tagつき Tagつき Tagの効果：最大値の低下

Senderを少なくする→Tagの効果UP＋delay発生 LVA-Tagの効果は？ XL10GOLD , Receiver ：　Sender = １０　：　１　　（ 3０℃ ） LuxI RhlI Tagなし Tagなし Tagつき Tagつき は Senderを少なくする→Tagの効果UP＋delay発生 　　　　　　AHL合成が少ないとき効果あり

タイムディレイテスト(温度依存性) ? 37℃ or 30℃ gfp LuxR plux Mix(t=0) 蛍光強度測定 Receiver Senders LuxI lasI RhlI

温度の影響は？ 37℃ 30℃ LasI：30℃の方が強い XL10GOLD , Receiver ： Sender = 1 : 1 LuxI LuxI RhlI RhlI LasI LasI LasI：30℃の方が強い

タイムディレイテスト(株依存性) LuxR plux gfp ptet plac plac Senders-JW1908 lasI RhlI LuxI Senders-XL10Gold lasI RhlI plac LuxI LuxR plux gfp ptet Receiver-JW1908

株の影響は？ JW1908 XL10GOLD Receiver ： Sender = 1 ： 1 （37℃） RhlI RhlI LuxI LasI LasI

タイムディレイテスト(菌数比の影響) ? 30℃ Receiver / Sender (R/S) = 1 =10 =100 gfp LuxR Mix(t=0) 蛍光強度測定 30℃ ? Senders Receiver / Sender (R/S) = 1 =10 =100 LuxI lasI RhlI

菌数比の影響は？ 30℃、JW1908 RhlI LasI S/R=10 S/R=1 S/R=10 S/R=1 S/R=100

実験の流れ Today テスト準備（8/17~） CrrosTalkテスト（9/2~） タイムディレイテスト（液体培地）(9/8~9/25） バラバラなパーツの組み直し CrrosTalkテスト（9/2~） Lux Las Rhl Cin Lux Las Rhl Cin タイムディレイテスト（液体培地）(9/8~9/25） Today タイムディレイテスト(固体培地)（9/26~）

5h後 2h後 8h後 結果予想図 タイムディレイテスト（固体培地spot） LuxR plux gfp ptet XL10GOLD , Receiver / Sender = 1, 37℃ LuxI LasI RhlI 5h後 2h後 8h後 LuxR plux gfp ptet 結果予想図 →輪の広がる速度に差が出る Receiver-JW1908

New Parts plac plac plac plac plac plac BBa_K0840012 BBa_K084008 luxI RhlI plac BBa_K084014 BBa_K084009 luxI plac RhlI plac LVA LVA BBa_K084007 BBa_K084010 lasI plac cinI plac LVA