Percutaneous carbon dioxide treatment with gas mist generator enhances collateral blood flow in the ischemic hindlimb Takanori Yamazaki1), Yasukatsu Izumi2), Yasuhiro Nakamura1), Akihisa Hanatani1), Kenei Shimada1), Takashi Muro1), Minoru Yoshiyama1) 1) Department of Internal Medicine and Cardiology, 2) Department of Pharmacology, Osaka city University Graduate School of Medicine Osaka, Japan

Background Carbon dioxide (CO2) bathing has been used to treat some cardiac diseases. The effect of CO2-enriched water on cutaneous circulation depends primarily on the vaso-dilatation effects elicited by the CO2 that diffuses into the subcutaneous tissue through the skin layers. Immersion of an ischemic hindlimb into CO2-enriched water caused a nitric oxide (NO)-dependent increase in collateral blood perfusion. A simple system other than a CO2 bathing system is needed. (Ito T et al. J Invest Dermatol. 1989) (Schnizer W et al. Int J Microcirc Clin Exp) (Irie H et al. Circulation 2005) Osaka City University

Schematic of the CO2 mist production unit CO2 gas 近年、 CO2 が血流改善を促進するという報告が数多くなされ、血管内皮細胞増殖因子である VEGF を介して血管拡張物質である一酸化窒素 NO の産生を促進し血流を改善するという機序も報告されています。 また炭酸泉においても血流を改善すると言われており、注目を集めていますが、本来の効果を発揮するほどの濃度の炭酸泉は数少なく、CO2 の効果をより効果的にもたらすデリバリーの方法が必要とされています。 そこで我々はミストに注目しました。局所に CO2 をミスト状にし処置する事で、CO2 の効果である血流改善効果が得られれば、虚血性疾患に対する新たな治療応用が可能ではないかと考え実験を行いました。 H2O (Made by Advance Biotron) Osaka City University

Objective We investigated 1) whether percutaneous CO2 mist has useful effects compared with CO2 gas, 2) whether percutaneous CO2 mist enhances blood flow in the ischemic hindlimb in mice. Osaka City University

mRNA expressions (qRT-PCR) proteome (iTRAQ and LC/MS/MS) Protocol Unilateral hindlimb ischemia (C57BL/6J mice) treatment　10min/day (d) 4 7 14 21 28 blood flow mRNA expressions (qRT-PCR) 4 7 capillary density (anti CD31) 28 proteome (iTRAQ and LC/MS/MS) 4 untreatment (N) mixed air mist treatment (AM) (N2: 80%, O2: 20%)　 CO2 gas alone treatment (CG) CO2 mist treatment (CM) Osaka City University

Changes in relative tissue blood flow 2 4 6 8 10 12 (min) CO2 mist treatment CO2 gas treatment 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 total Hb oxy Hb deoxy Hb gas or mist filling 以上の結果をまとめると… BOM-L1TR SF, Omegawave Inc, Tokyo, Japan Osaka City University

Laser Doppler Blood Flow pre post Ischemia/non-ischemia *p<0.05 vs N at each time point 1.2 N: n=14 AM: n=15 28 days after ischemia 1.0 CM: n=18 * 0.8 * * * 0.6 N AM 0.4 こちらはレーザードップラー血流測定装置により虚血前、虚血直後、さらに虚血後２８日における血流を測定したものです。 色が白に近いものほど血流が豊富であることを示しており、青に近いものほど血流が乏しい事を示しています。 虚血前に見られた血流は虚血後に無くなり、２８日ではコントロール群においてもこのように回復します。 ＣＯ２ミスト群ではコントロール群よりも血流改善が促進されている。 この血流改善効果はＬ－ＮＡＭＥを併用する事で抑制されました。エアーミスト群ではコントロール群と差異は見られませんでした。 Blood flow Colored pixel 0.2 4 7 14 21 28 (days) CM Osaka City University

Immunostaining with anti-CD31 Ab control (N) air mist (AM) capillary density (28 days) *P < 0.05 vs N (/mm2) 120 * 100 80 CO2 mist (CM) 60 40 20 N AM CM Osaka City University

mRNA expressions 4 days after ischemia *p<0.05 vs N VEGF/GAPDH FGF/GAPDH eNOS/GAPDH 2 2 2 * * 1 1 1 N AM CM N AM CM N AM CM 7 days after ischemia VEGF/GAPDH FGF/GAPDH eNOS/GAPDH 2 2 2 * 1 1 1 N AM CM N AM CM N AM CM Osaka City University

Identified protein: 195 (reliability > 95%) The number of identified proteins by iTRAQ and LC/MS/MS Cont iTRAQ 114 N iTRAQ 115 CM iTRAQ 116 each n=5, pooling LC/MS/MS Identified protein: 195 (reliability > 95%) by ischemia (114 vs 115) 115/114 > 120% 68 proteins 115/114 < 80% 62 proteins by CO2 mist down-regulated (116/115 < 80%) up-regulated (116/115 > 120% 18 proteins 12 proteins signal transduction etc. metabolic enzyme etc. Osaka City University

Blood flow improvement (capillary density ↑, VEGF ↑) Summary CM group had significantly increased oxygenated hemoglobin level and decreased deoxygenated hemoglobin level compared with AM and CG group. CM group had significantly accelerated angiogenesis after ischemia compared with N and AM groups. ischemic hindlimb CO2 mist Blood flow improvement (oxy Hb ↑, deoxy Hb ↓) Angiogenesis (capillary density ↑, VEGF ↑) Vasodilatation? Osaka City University

Conclusion Percutaneous CO2 mist therapy may be a potentially useful for ischemia-induced angiogenesis. 近年、 CO2 が血流改善を促進するという報告が数多くなされ、血管内皮細胞増殖因子である VEGF を介して血管拡張物質である一酸化窒素 NO の産生を促進し血流を改善するという機序も報告されています。 また炭酸泉においても血流を改善すると言われており、注目を集めていますが、本来の効果を発揮するほどの濃度の炭酸泉は数少なく、CO2 の効果をより効果的にもたらすデリバリーの方法が必要とされています。 そこで我々はミストに注目しました。局所に CO2 をミスト状にし処置する事で、CO2 の効果である血流改善効果が得られれば、虚血性疾患に対する新たな治療応用が可能ではないかと考え実験を行いました。 Osaka City University