血液中のダイオキシン類・ PCB 分析と異性体組 成 増崎優子・松村徹 (国土環境株式会社 環境創造研究所 環境リスク研究センター) 静岡県志太郡大井川町利右衛門1334-5 Phone : Facsimile : Home page:
ヒトのダイオキシン類による曝露の調査 試料候補 としては ・母乳・組織・毛髪 etc . 長所:被験者によらず採取可能 短所:濃度が低い 多量の試料を採取することが不可 能 血液 超微量分析 ブランク・感度の問 題
ブランクの低減のために(実験室) クリーンルーム( 有機物質対応 クラス 未満 ) 血液分析室 プレフィルター 活性炭フィルター HEPA フィルター 陰圧 陽圧 HEPA フィルター 放電 フィルター
ブランクの低減のために(試薬) 使用する全ての有機溶媒 クリーンルーム内にて非沸騰蒸留 アルカリ溶液・硫酸 蒸留したヘキサンにて振とう洗浄( 30min×3 ) シリカゲル・無水硫酸ナトリウム ( 1:4 )アセトン/トルエンにて超音波洗浄 ( 90min )及びソックスレー洗浄( 7days ) クリーンオーブンにて加熱処理( 400 ℃, 4hr ) 活性炭シリカゲル
ブランクの低減のために(器具) 使用する全てのガラス器具 クリーンオーブンにて加熱処理( 450 ℃, 4hr ) GC-MS 血液専用機を用意
GC - MS の感度向上のために 実際に使用したカラム; BPX5 (長さ: 30m ,内径: 2.5mm ,膜厚: 0.25μm , SGE 社製) 10fg で S/N5 ~ 10 ( OCDD / OCDF 以外の 2,3,7,8- 位置換異性体) GC (HP6890) 熱耐性に優れ,バックグラウンドノイズの少ないカラムを採用 MS ( micromass AutoSpec-Ultima ) 12C と 13C , PFK とでデータの取り込み時間を変えた 濃縮 最終溶媒容量: 10μL
全血 ( 50mL ) クリーンアップスパイク 2N 水酸化カリウム/エタノール溶液 硫酸処理 ヘキサン層水層 放置 ヘキサン 抽出 エタノール 水 多層シリカゲルカラムクロマトグラフィー 活性炭埋蔵シリカゲルカラムクロマトグラフィー シリンジスパイク HRGC - HRMS 測定 前処理方法 (試料量 50mL の場合)
最終容量を 10μL 注入量を 2μL 脂肪量を 0.3 ~ 0.8% 試料量 50mL が必要 被験者の負担が大きい GC-MS 感度 (標準溶液測定時) 10fg で S/N 5 ~ 10 目標定量下限: 1pg/g-fat ( 2,3,7,8-TeCDD ) 血液中ダイオキシン類測定に必要な試料量 とすると...
注入量を 2μL 注入量を 10μL 試料量 50mL が必要 試料量 10mL で測定分析が可能
(例) 採血量 :( 50mL ) 採血容器:(採血バッグ) (真空採血管) (例) 使用試薬量および使用ガラス器具のスケールダウン 精製工程の一部省略 被験者の負担軽減 前処理の負担軽減 効果 ( 10mL )
Solvent Cut Valve Coolant ( Liquid CO 2 ) Make up Gas Pre-Column : BPX5 (0.25mmID × 6m 1.0um) Injector Carrier Gas Analytical Column : Trap : Cooling MID Point-1 MID Point-2 Purge HRMS SCLV Injection System 概念図 BPX-Dioxin-I (0.15mmID × 30m)
全血 ( 1 0mL ) クリーンアップスパイク 飽和硫酸アンモニウム溶液 ヘキサン層水層 重量測定 ヘキサン 抽出 エタノール/ヘキサン 多層シリカゲルカラムクロマトグラフィー 活性炭埋蔵シリカゲルカラムクロマトグラフィー シリンジスパイク HRGC - HRMS 測定 前処理方法 (試料量 10mL の場合) 抽出 ★ ★
日本人血液中のダイオキシン類異性体組成 ( PCDDs/DFs 実測濃度) 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF1,2,3,4,7,8,9-HpCDF OCDD 2,3,7,8-TeCDD 2,3,4,7,8-PeCDF 2,3,7,8-TeCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDD1,2,3,6,7,8-HxCDD1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDF1,2,3,6,7,8-HxCDF1,2,3,7,8,9-HxCDF2,3,4,6,7,8-HxCDF OCDF Total PCDDs Total PCDFs 83.1%94.2% ( n=51 4 ) Total (PCDDs+PCDFs) を 100% とした場合の各異性体の割合
日本人血液中のダイオキシン類異性体組成 ( Co-PCBs 実測濃度) 3,3 ’,4,4 ’ -TeCB(#77) 2,3,3 ’,4,4 ’,5,5 ’ -HpCB(#189) 2,3,3 ’,4,4 ’,5 ’ -HxCB(#157) 2,3,3 ’,4,4 ’,5-HxCB(156) 2,3 ’,4,4 ’,5-PeCB(#118) 2 ’,3,4,4 ’,5-PeCB(#123) 2,3,4,4 ’,5-PeCB(#114) 2,3,3 ’,4,4 ’ -PeCB(#105) non-ortho PCBs 3,3 ’,4,4 ’,5,5 ’ -HxCB(#169) 3,3 ’,4,4 ’,5-PeCB(#126) 3,4,4 ’,5-TeCB(#81) 2,3 ’,4,4 ’,5,5 ’ -HxCB(#167) mono-ortho PCBs 50.3%99.6% ( n=51 4 ) Total Co-PCBs を 100% とした場合の各異性体の割合
日本人血液中のダイオキシン類異性体組成 ( TEQ ) 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF1,2,3,4,7,8,9-HpCDF OCDD 2,3,7,8-TeCDD 2,3,4,7,8-PeCDF 2,3,7,8-TeCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDD1,2,3,6,7,8-HxCDD1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDF1,2,3,6,7,8-HxCDF1,2,3,7,8,9-HxCDF2,3,4,6,7,8-HxCDF OCDF Total PCDDs Total PCDDs+PCDFs Total PCDFs 3,3 ’,4,4 ’ -TeCB(#77) 2,3,3 ’,4,4 ’,5,5 ’ -HpCB(#189) 2,3,3 ’,4,4 ’,5 ’ -HxCB(#157) 2,3,3 ’,4,4 ’,5-HxCB(156) 2,3 ’,4,4 ’,5-PeCB(#118)2 ’,3,4,4 ’,5-PeCB(#123) 2,3,4,4 ’,5-PeCB(#114) 2,3,3 ’,4,4 ’ -PeCB(#105) non-ortho PCBs 3,3 ’,4,4 ’,5,5 ’ -HxCB(#169) 3,3 ’,4,4 ’,5-PeCB(#126) 3,4,4 ’,5-TeCB(#81) 2,3 ’,4,4 ’,5,5 ’ -HxCB(#167) mono-ortho PCBs Co-PCBs ( n=51 4 ) Total (PCDDs+PCDFs+Co-PCBs) を 100% とした場合の各異性体の割合
日本人血液中のダイオキシン類異性体組成 ( TEQ ) ( n=25 3 ) 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF1,2,3,4,7,8,9-HpCDF OCDD 2,3,7,8-TeCDD 2,3,4,7,8-PeCDF 2,3,7,8-TeCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDD1,2,3,6,7,8-HxCDD1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDF1,2,3,6,7,8-HxCDF1,2,3,7,8,9-HxCDF2,3,4,6,7,8-HxCDF OCDF Total PCDDs Total PCDDs+PCDFs Total PCDFs 3,3 ’,4,4 ’ -TeCB(#77) 2,3,3 ’,4,4 ’,5,5 ’ -HpCB(#189) 2,3,3 ’,4,4 ’,5 ’ -HxCB(#157) 2,3,3 ’,4,4 ’,5-HxCB(156) 2,3 ’,4,4 ’,5-PeCB(#118)2 ’,3,4,4 ’,5-PeCB(#123) 2,3,4,4 ’,5-PeCB(#114) 2,3,3 ’,4,4 ’ -PeCB(#105) non-ortho PCBs 3,3 ’,4,4 ’,5,5 ’ -HxCB(#169) 3,3 ’,4,4 ’,5-PeCB(#126) 3,4,4 ’,5-TeCB(#81) 2,3 ’,4,4 ’,5,5 ’ -HxCB(#167) mono-ortho PCBs Co-PCBs
日本人血液中のダイオキシン類異性体組成 ( TEQ ) 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF1,2,3,4,7,8,9-HpCDF OCDD 2,3,7,8-TeCDD 2,3,4,7,8-PeCDF 2,3,7,8-TeCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDD1,2,3,6,7,8-HxCDD1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDF1,2,3,6,7,8-HxCDF1,2,3,7,8,9-HxCDF2,3,4,6,7,8-HxCDF OCDF Total PCDDs Total PCDDs+PCDFs Total PCDFs 3,3 ’,4,4 ’ -TeCB(#77) 2,3,3 ’,4,4 ’,5,5 ’ -HpCB(#189) 2,3,3 ’,4,4 ’,5 ’ -HxCB(#157) 2,3,3 ’,4,4 ’,5-HxCB(156) 2,3 ’,4,4 ’,5-PeCB(#118)2 ’,3,4,4 ’,5-PeCB(#123) 2,3,4,4 ’,5-PeCB(#114) 2,3,3 ’,4,4 ’ -PeCB(#105) non-ortho PCBs 3,3 ’,4,4 ’,5,5 ’ -HxCB(#169) 3,3 ’,4,4 ’,5-PeCB(#126) 3,4,4 ’,5-TeCB(#81) 2,3 ’,4,4 ’,5,5 ’ -HxCB(#167) mono-ortho PCBs Co-PCBs ( n=25 3 )
ヒトの PCB による曝露の調査 複数のカラムを用いて個別に定量 PCB 全異性体を個別に定量可能なカラムは存在しない PCB の詳細な異性体組成は不明
複数のカラムを用いた PCB 全異性体の定量
☆ :組み合わせて計算することが可能
血液中の PCB 全異性体組成 BZ# ( n=10 )
血液中の PCB 全異性体組成 ( n=10 ) BZ#
血液及び KC-300 中の PCB 全異性体組成比較 BZ# 血液 KC
120 9 BZ# 血液及び KC-400 中の PCB 全異性体組成比較 血液 KC
120 9 BZ# 血液及び KC-500 中の PCB 全異性体組成比較 血液 KC
120 9 BZ# 血液及び KC-600 中の PCB 全異性体組成比較 血液 KC
血液中の主な PCB 異性体 #74 #194 #187 #201 #183 #180 #177 #178 #170 #163 #153 #146 #118 #138 #99
血液への残留性 #149 #153 #174 #101 #70#52#110 #74 #180 #138 残留性:高残留性:低
まとめ 日本人の血液中のダイオキシン類の 濃度・組成は,ほぼ判 明した. 複数のカラムを用いる手法により, ヒト血液中の詳細な PCB 全異性体組成が分 かった.