薬品分析学３

演習 HPLCの構成要素を順番に並べなさい。 ポンプ 記録計 カラム 圧力計 検出器 溶媒(移動相液体)の瓶 試料導入部(インジェクター)

光学分割 (鏡像異性体の分離) 鏡像異性体 (対掌体): エナンチオマー (enantiomer) 旋光度以外の物性が同じ 通常のカラムで分離不能

ジアステレオマー (diastereomer) ジアステレオマー＆エナンチオマー 不斉中心が2つ以上ある化合物 エナンチオマー (enantiomer) 立体異性体 ジアステレオマー (diastereomer) 3-クロロ-2-ブタノール (Fischer 投影式) CH3 H OH Cl * * S * * R

ジアステレオマー＆エナンチオマー ジアステレオマー (diastereomer) 不斉中心が2つ以上ある化合物にしかジアステレオマーは 存在しない 不斉中心が2つ以上ある化合物の異性体 CH3 H OH Cl S R * CH3 Cl HO H R S * エナンチオマー (enantiomer) の関係 対称面 ジアステレオマー (diastereomer) の関係 エナンチオマー以外の関係

ジアステレオマー＆エナンチオマー 3-クロロ-2-ブタノール (Fischer 投影式) エナンチオマー (enantiomer) の関係 OH Cl CH3 H HO Cl S * * R * * R ジアステレオマー (diastereomer) の関係 CH3 Cl H OH CH3 Cl HO H ジアステレオマー 別化合物 * * S R S * * 通常クロマトグラフィー で分別可能

クロマトグラフィーによる光学分割 キラル固定相法 キラル化合物(分離対象) R R R R R S S R R R R R S R R R キラル化合物(固定相) キラル移動相法 R R R S S R R R R R S R R R R R R 固定相 R 固定相 S R R S R キラル化合物(移動相)

ジアステレオマー(diastereomer)の関係 クロマトグラフィーによる光学分割 ジアステレオマー法 R S R R S R R R R S R 固定相 固定相 R R R S R R 固定相 R R S 共有結合形成 キラル化合物 R R S 化学反応 通常クロマトグラフィー で分別可能 + R S R R 別化合物 ジアステレオマー(diastereomer)の関係

ジアステレオマー：例 グルコース マンノース ガラクトース 環状構造 還元型構造 * * * Fischer 投影式 * * * * * * 融点 α:146 ℃ / β:150 ℃ 132～133℃ α:167 ℃ / β:143-145 ℃ 甘味度(vsショ糖) 0.69 0.59 0.63 ジアステレオマー の関係 ジアステレオマー 別化合物 通常クロマトグラフィー で分別可能

ジアステレオマー(diastereomer) クロマトグラフィーによる光学分割 キラル固定相法 R R R R R R R R R R R R 右足には右足用の靴 キラル移動相法 R R 別物 R S 通常クロマトグラフィー で分別可能 ジアステレオマー(diastereomer) 的な関係

キラル固定相法・キラル移動相法に用いられるキラル化合物 教科書 P183 図3-35

宿題(締切: 6/11(木)，田中の部屋の前のカゴ) 演習 HPLCの構成要素を順番に並べなさい。 ポンプ 記録計 カラム 圧力計 検出器 溶媒(移動相液体)の瓶 試料導入部(インジェクター) 宿題(締切: 6/11(木)，田中の部屋の前のカゴ) 以下の物質から「原理的にキラル固定相になるもの」と「原 理的にキラル移動相になるもの」をそれぞれ選びなさい。 ベンゼン グルコース アルブミン ポリエチレングリコール オクタデシルシリル基 シクロヘキサン ろ紙 プロリン

宿題(締切: 6/11(木)，田中の部屋の前のカゴ) 以下の物質から「原理的にキラル固定相になるもの」と「原 理的にキラル移動相になるもの」をそれぞれ選びなさい。 ベンゼン グルコース アルブミン ポリエチレングリコール オクタデシルシリル基 シクロヘキサン ろ紙 プロリン キラル固定相になるもの: グルコース アルブミン ろ紙 プロリン 不斉(キラル)中心を有した化合物 キラル移動相になるもの: グルコース アルブミン プロリン 不斉(キラル)中心を有した化合物、かつ、溶媒に溶解する物質

電気泳動 電気泳動装置(ポリアクリルアミドゲル) パワーサプライ(電源装置) 出典 Wikipedia「ポリアクリルアミド電気泳動」 出典 http://www.tech-jam.com/campaign/budget/bio_10.phtml

ポリアクリルアミドゲル ポリアクリルアミドゲル ポリアクリルアミドゲル化学構造 出典: http://www-mls.tsurumi.yokohama-cu.ac.jp /stbiol/protocols/SDS_PAGE.pdf ポリアクリルアミドゲル化学構造

電気泳動(アガロースゲル) 電気泳動装置(アガロースゲル) パワーサプライ(電源装置) 出典: 教科書P218 図3-56 注意: 教科書の図3-56(b) の図はアガロースゲル電気泳動槽の図

アガロースゲル アガロースゲル アガロース: 寒天の主成分 上記単位構造が連なっ た多糖類(ポリサッカラ イド) 見ての通り寒天だ！ 　　　寒天の主成分 上記単位構造が連なっ た多糖類(ポリサッカラ イド) 見ての通り寒天だ！ 出典: http://munetoshi.blog50.fc2.com/ blog-date-200805.html

ポリアクリルアミドゲル/アガロースゲル アガロースゲル ポリアクリルアミドゲル ポリマー(長鎖化合物)がからまって固まったもの 電荷が同じなら − ゲルの網目を抜けでる速さ >> 分子ふるい効果 分子量の小さな分子が早く 泳動される ゲルろ過と逆 分子量が同じなら電荷の大 きな分子が早く泳動される +

電気泳動速度 移動速度 v: 移動速度; μ: 移動度; V: 電圧; L: 電極間距離; E: 電場強度 移動度 Q: 化合物電荷; π: 3.14•••; η: 溶媒粘度; r: 化合物半径 化合物半径 r ↑ 移動度 μ ↓ (μ ∝ 1/r) 化合物が大きくなると、泳動速度が遅くなる 化合物電荷 Q ↑ 移動度 μ ↑ (μ ∝ Q) 溶媒粘度 η ↑ 移動度 μ ↓ (μ ∝ 1/η)

ポリアクリルアミドゲル/アガロースゲル: 応用 核酸の鎖長決定 (プラスミド等) 核酸の鎖長決定 蛋白質の分子量決定 蛋白質の等電点決定 − − 核酸−蛋白質の結合定数決定 疎水性コア 蛋白質の構造形成原理 − + −

ポリアクリルアミドゲル: SDS-PAGE 負電荷 − SDS: sodium dodecyl sulfate (界面活性剤) 　　 別名：ラウリル硫酸ナトリウム = = 蛋白質の変性剤 PAGE: PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 　　　 (ポリアクリルアミドゲル電気泳動) 長鎖脂肪鎖 (疎水性) − − − − − − − − − 蛋白質側鎖 − 蛋白質主鎖 蛋白質の構造を崩す 分子量に依存した長さ(大きさ) 鎖長に応じた泳動度 蛋白質の分子量決定

キャピラリー電気泳動 装置概略 キャピラリー: フューズドシリカ(溶融石英)をポリイミドでコート 電源: 高圧電源 (10k〜30kV, 250 μA 以下) 検出器: 紫外吸光度(UV)検出器、フォトダイオードアレイ検出器 資料注入: 落差法(サイホン)、吸引法、加圧法、(電気)泳動法

キャピラリー電気泳動：分類 キャピラリーゾーン電気泳動 支持体：なし(電解質溶液) 泳動の駆動力：電気浸透流(電荷(+,N,−)に関わらず陰極側へ) 泳動速度：陽イオン > 中性物質 > 陰イオン Si O Si O Si O− OH O− − + + 電気浸透流 電気浸透流の元 電気二重層 壁近傍の陽イオンの流れが駆動力 泳動界面が平ら 高分離能のクロマトグラフィー(電気泳動)

キャピラリー電気泳動：分類 キャピラリーゲル電気泳動 支持体：あり(ポリアクリルアミド、アガロース等) 泳動の駆動力：静電引力 泳動速度：分子ふるい効果(大きな分子が遅い) キャピラリー中のゲル電気泳動

キャピラリー電気泳動：分類 ミセル動電クロマトグラフィー 泳動液：イオン性ミセル添加電解溶液 泳動の駆動力：電気浸透流(ミセルの泳動は遅い) 泳動速度：ミセル相と水相との分配平衡 ミセル相に取込まれやすい化合物の泳動が遅れる

キャピラリー電気泳動：応用 DNA塩基配列解析(シーケンシング) キャピラリーゲル電気泳動 どちらか不明 キャピラリーゾーン電気泳動 生命科学(ゲノム配列解析)を飛躍的に進めた装置

演習 化合物(a)〜(c)のうち、四角で囲んだ化合物と「キラル固定相法」 「キラル移動相法」等の光学分割が必要な化合物と、通常カラム (b) (c) CH3 H OH Cl CH3 H HO Cl CH3 Cl H OH CH3 Cl HO H S * * * * R S R S * * * * R 光学分割が必要な化合物： 通常カラムで分離可能な化合物：

宿題(締切: 6/18(木)，田中の部屋の前のカゴ) 分子(a)〜(c)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。 (a) 電荷価数: -5, 半径: 9 nmの球 (b) 電荷価数: -1, 半径: 3 nmの球 (c) 電荷価数: -2, 半径: 60×10-10 mの球 分子(d)〜(f)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。 ただし球状蛋白質の密度は全て同じで、蛋白質は完全な球体 であるものとする。 (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 (e) 電荷価数: -4, 分子量: 12000の球状蛋白質 (f) 電荷価数: -6, 分子量: 15000の球状蛋白質

宿題(締切: 6/18(木)，田中の部屋の前のカゴ) 分子(a)〜(c)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。 e: 電子1個の電荷 -1.602×10-19 (C) (a) 電荷価数: −5, 半径: 9 nmの球 (5e) 5e 移動度 = = 6πη×9 54πη クーロン (b) 電荷価数: −1, 半径: 3 nmの球 (1×e) e 3e 移動度 = = = 6πη×3 18πη 54πη (c) 電荷価数: −2, 半径: 60×10-10 mの球 60×10-10 m = 6×10-9 m = 6 nm (2e) e 3e 移動度 = = = 6πη×6 18πη 54πη 答　(a) > (b) ≈ (c)

宿題(締切: 6/18(木)，田中の部屋の前のカゴ) 分子(d)〜(f)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。 ただし球状蛋白質の密度は全て同じで、蛋白質は完全な球体 であるものとする。 単位(C) 移動度 単位(m) (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 単位(g/mol = g•mol-1) 分子1 molの質量 分子量 ≠ 半径 ( r に分子量を代入してはダメ!) ただし、分子量と半径 r には一定の関係がある(関数関係) 分子量 → 半径 の変換が肝！ 蛋白質1個の質量 = 分子量／アボガドロ数 (NA) = 9000/NA (g)

単位(C) 移動度 単位(m) (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 単位(g/mol = g•mol-1) 分子1 molの質量 分子量 ≠ 半径 ( r に分子量を代入してはダメ!) ただし、分子量と半径 r には一定の関係がある(関数関係) 分子量 → 半径 の変換が肝！ 蛋白質1個の質量 = 分子量／アボガドロ数 (NA) = 9000/NA (g) 蛋白質1個の体積 =蛋白質1個の質量／密度 (a (g/m3)) = {9000/NA (g)}/a (g/m3) 9000 = (m3) NA•a 4πr3 蛋白質1個の体積 = (m3) (球の体積の公式) 3

√ √ 単位(C) 移動度 単位(m) (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 単位(g/mol = g•mol-1) 分子1 molの質量 9000 4πr3 蛋白質1個の体積 (m3) = = NA•a 3 4πr3 NA•a 9000 (球の体積の公式) = 3 3×9000 27000 r3 = = 4πNA•a 4πNA•a √ 3 27000 √ 3 1 r = = 30 4πNA•a 4πNA•a

√ √ √ √ √ √ √ √ √ √ (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 27000 1 r = = 30 (m) 4πNA•a 4πNA•a (e) 電荷価数: -4, 分子量: 12000の球状蛋白質 √ 3×分子量 √ 3×12000 √ 36000 √ 3 3 3 3 36 r = = = = 10 4πNA•a 4πNA•a 4πNA•a 4πNA•a (m) (f) 電荷価数: -6, 分子量: 15000の球状蛋白質 √ 3 3×分子量 √ √ √ 3 3×15000 3 45000 3 45 r = = = = 10 4πNA•a 4πNA•a 4πNA•a 4πNA•a (m)

√ √ √ (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 Q μ(d) = 6πηr = 6πη r 1 5e 27000 4πNA•a √ 3 e 53×4πNA•a 54 πNA•a (e) 電荷価数: -4, 分子量: 12000の球状蛋白質 μ(e) = Q 6πη r 1 4e = 36000 4πNA•a √ 3 e 140.6 πNA•a (f) 電荷価数: -6, 分子量: 15000の球状蛋白質 μ(f) = Q 6πη r 1 6e = 45000 4πNA•a √ 3 e 52.08 πNA•a 答: (f) > (d) > (e)

分離分析：まとめ DNA塩基配列解析(シーケンシング) キャピラリーゲル電気泳動 どちらか不明 キャピラリーゾーン電気泳動 生命科学(ゲノム配列解析)を飛躍的に進めた装置