実習の前に … 黒田研の実習では、ファイルをダウンロードしても らうことが多くあります。 まずは、下記のホームページを開いてください。 tokyo.ac.jp/class/Summer/2013 → 直打ち または ① Google で「東京大学黒田研究室」検索 ②黒田研の H.P. に入り、 以下を class/Summer/2013 に変更

現象の特性 微分回路、積分回路、プローブ特性、 アナログデジタル変換、メモリ、振動現象 実習アウトライン これらはシンプルな分子ネットワークの 組み合わせで生まれる！ 前向き制御（フィードフォワード） 後向き制御（ポジティブ、ネガティブ フィードバック）

Tempo ral rate Ras 微分回路、積分回路 リズムと周波数応答 プローブの問題 分子で作るメモリ アナログデジタル変換 実習アウトライン

シミュレーション演習 狙い 初日 イントロ 2日目 プローブと信号 3日目 実験結果からの数理モデル作成 4日目 時間パターンに対する選択的応答 5日目 スイッチ応答とメモリ 6日目 振動現象

シミュレーション演習 狙い 初日 イントロ 2日目 プローブと信号 3日目 実験結果からの数理モデル作成 4日目 時間パターンに対する選択的応答 5日目 スイッチ応答とメモリ 6日目 振動現象

6 2. Circuit Engineering Genetic Circuits 1 次反応 ; 例 ; タンパク質などの分解, 放射性同位元素の崩壊 準備体操 生化学反応の基本的なふるまい ポイント Memoryless property その時その時でいつも同じ。履歴を引きずらない x 分解  ただし、 t = 0 のとき、 x=A 0 t x(t)x(t)

7 2. Circuit Engineering Genetic Circuits 逐次 1 次反応；leaky integrator（漏れ積分器） 1 次反応に外部入力 ( ステップ刺激）を加える 準備体操 生化学反応の基本的なふるまい x 分解  I ただし、 t = 0 のとき、 x = 0 空気抵抗を考えた場合の自由落下の式と同じ。 穴のあいたバケツに水を一定速度で入れるのとも同じ。 Leak （漏れ） Integrator ( 積分器） I t  x(t)x(t) 

time A AB  生化学反応は漏れ積分で近似できる

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2008 ノーベル化学賞 緑色蛍光蛋白質の発見と開発 細胞 組織 個体 生体を生きたまま非侵襲に染色、可視化できる 望みの部位だけ可視化できる 蛋白質の発現等を定量できる

シミュレーション演習 狙い 2日目 プローブと信号 Ca2+プローブのダイナミックレンジ 時定数 Transient and sustainedのどちらをひろうか。 (decoupling, coupling) 図と説明

Ca 2+ イメージング （膵臓ランゲルハンス島） グルコース刺激した膵臓ランゲルハンス島のカルシウム応答 すべてのカルシウム応答が見えている ? 生体内のカルシウム応答（ <100nM, 数十 マイクロ秒）

Ca 2+ プローブと反応速度定数 - バイオプローブ‐ プローブの応答はカルシウム濃度の変化を正しく反映している？ ⇒必ずしもカルシウム波形が正確に反映されているわけではない プローブを使う際は応答速度に注意する。 Ca2+ インパルス刺激（※ 50msec 幅の矩形波を仮定 ) 50ms 0.5Hz1Hz2Hz

シミュレーション演習 狙い 初日 イントロ 2日目 プローブと信号 3日目 実験結果からの数理モデル作成 4日目 時間パターンに対する選択的応答 5日目 スイッチ応答とメモリ 6日目 振動現象

分化 増殖 EGF 一過性 ERK 活性化 NGF 持続性 ERK 活性化 Time EGF or NGF PC12 cells （ precursor of neuron ） 細胞運命決定機構：増殖と分化のスイッチ 現象を分子に帰着せさることができない！ ERK の時間波形が異なるだけで異なる現象を制御 エンコー ド デコード

EGF Transient ERK activation Sustained ERK activation NGF Ras と Rap1 による ERK 活性の制御

不活性化機構が違いを生み出す ! SOS TrkA RasGAP Ras GAP i pR GEF i GEF RasRas i GAP C3G TrkA Rap1GAP Rap1pR GEF i GEF Rap1Rap1 i GAP Rap1 積分回路 Ras 微分回路 pR dependent pR independent (constant)

実験結果からモデルのパラメータを決める t y k=ak=a k=bk=b t y k=ak=a k=bk=b <

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分化 増殖 EGF 一過性 ERK 活性化 NGF 持続性 ERK 活性化 Time EGF or NGF PC12 cells （ precursor of neuron ） 細胞運命決定機構：増殖と分化のスイッチ 現象を分子に帰着せさることができない！ ERK の時間波形が異なるだけで異なる現象を制御 エンコー ド デコード

EGF Transient ERK activation Sustained ERK activation NGF Ras と Rap1 による ERK 活性の制御

不活性化が一定 刺激の速さに応答：微分回路 刺激の強さに応答：積分回路 Sasagawa, S. et al, Nat. Cell Biol. 2005, 7 (4), Encoders Rap1 t t t Ras 速い活性化と遅い不活性化 Growth factors Ras Receptor GEFGAP ERK Rap1 Receptor GEF GAP ERK Ras と Rap1 経路の特性の違い

Ras のシンプルモデル GEF GAP 速い活性化と遅い不活性化 Ras Receptor GEFGAP ERK incoherent FeedFowared Loop (iFFL) → 時間変化を捉える！ q < 1: GEF が早い q > 1 : GEF が遅い

Ras のシンプルモデル 速い活性化と遅い不活性化 Ras Receptor GEFGAP ERK incoherent FeedFowared Loop (iFFL) → 時間変化を捉える！ q < 1: GEF が早い q > 1 : GEF が遅い

刺激のスピードと q の関係に着目！ GEF GAP ステップ ランプ ランプ刺激：刺激の速度を変えよう r: (rate of pR) Ras

刺激の速度に対する一過性 ERK の応答 EGF 刺激 Ras のシステムは刺激の速度（強度ではない）を捉えていた。

EGF NGF 持続性 ERK の活性化 ? ? Inactivation is constant

NGF stimulation NGF の最終濃度（強度） → 持続性 ERK の活性 化 NGF 刺激の速度を変えてみると

Rap1 と Ras のシンプルモデル SOS TrkA RasGAP Ras GAP i pR GEF i GEF RasRas i GAP C3G TrkA Rap1GAP Rap1pR GEF i GEF Rap1Rap1 i GAP Rap1 Ras ：さっきと同じ 刺激依存 刺激非依存 (constant) 違いはたった一つ

Ras と Rap1 の定常状態 Rap1 Ras

刺激 ステップ t t t Ras-like system ( 微分回路） Rap1-like system ( 積分回路） 速い、遅い時間成分 t パルス t t 速い時間成分 t ランプ t t 遅い時間成分 Ras と Rap1 経路の特性の違い 刺激の時間パターンに情報が入っていた！

ON OFF ON Ras/Rap1 Growth factor 分化増殖 Encoder Decoder1Decoder2 ERK gene A gene B gene A gene B ERK へのエンコー ド 下流でのデコード 異なる現象（増殖と分 化） 刺激の時間情報 活性化 ERK の時間情報デコーディング ノイズで分化したくないベースの変動で増殖したくない 広い意味での周波数応答

分子は媒体 TAKE HOME MESSAGE

分子自体は情報ではない！ 分子は媒体 電磁波 周波数、振幅 空気振動 音楽、ニュース 成長因子 時間波形 細胞増殖 シグナル分子波形 細胞分化 分子やネットワークは媒体 → 情報を伝えるもの 分子の「変動パターン」が情報 → 分子ネットワークの上を伝わるもの

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大腸菌 lac オペロンの双安定性 大腸菌は糖の濃度 を記憶する ポジティブ・ フィードバックで 記憶する 協調作用 Ozbudak et al. (2004) Nature

記憶（ Hysteresis) のある（ない ） スイッチ応答 time y (LacY-GFP) 記憶なしスイッチ （ポジティブフィードバックなし） ヒステリシスありヒステリシスなし 記憶ありスイッチ （ポジティブフィードバックなし）

シミュレーション演習 狙い 初日 イントロ 2日目 プローブと信号 3日目 実験結果からの数理モデル作成 4日目 時間パターンに対する選択的応答 5日目 スイッチ応答とメモリ 6日目 振動現象

39 Michael B. Elowitz & Stanislas Leibler,2000,Nature 入力 ネガティブフィードバックのみ Repressilator

ポジティブ + ネガティブフィードバック Stim. elec Recd. elec Action potential ( 活動電位） Hodgkin Huxley model ↓ FitzHugh-Nagumo model

時間情報コード （ローカル） ボトムアップ 縮約（単純化） 動作原理 トランスオミクス （グローバル） トップダウン 今回の実習はボトムアップ 最先端ではトップダウンも組み合わせる

グローバル ローカル １．トランスオミクス 生体のホメオスタシス（恒常性） インスリン作用のシステム生物学 ２．時間情報コード

インスリンの作用と標的臓器 炭水化物の全身での代謝を制御 グリコーゲン合成、糖新生、タンパク質合成 血糖を下げる唯一のホルモン インスリンが作用できなくなると糖尿病に インスリンの放出

インスリン作用のシステム生物学 個別の実験結果を人手で 自分の頭の中で再構築 それをマンガで表現 木を見て森を描く

インスリン作用のシステム生物学 個別の実験結果を人手で 自分の頭の中で再構築 それをマンガで表現 ハイスループットに大量計測 計算機を使って再構築を自動化 ルールに基づき表現 これから 木を見て森を描く 森を描いてから木を見る

インスリン シグナル伝達 代謝物 リン酸化 アロステリック 制御 インスリン作用の全貌 Phospho-proteome

48 インスリン リン酸化プロテオミクス メタボロミクス ③ ④ トランスオミクス解析による インスリン作用経路の自動同定 1. 代謝物 2. 境界酵素 3. 境界酵素のリン酸化 4. インスリンから境界酵 素までの経路同定 5. 代謝物によるアロステ リック制御