薬品分析学３

キャピラリー電気泳動 装置概略 キャピラリー: フューズドシリカ(溶融石英)をポリイミドでコート 電源: 高圧電源 (10k〜30kV, 250 μA 以下) 検出器: 紫外吸光度(UV)検出器、フォトダイオードアレイ検出器 資料注入: 落差法(サイホン)、吸引法、加圧法、(電気)泳動法

キャピラリー電気泳動：分類 キャピラリーゾーン電気泳動 支持体：なし(電解質溶液) 泳動の駆動力：電気浸透流(電荷(+,N,−)に関わらず陰極側へ) 泳動速度：陽イオン > 中性物質 > 陰イオン Si O Si O Si O− OH O− − + + 電気浸透流 電気浸透流の元 電気二重層 壁近傍の陽イオンの流れが駆動力 泳動界面が平ら 高分離能のクロマトグラフィー(電気泳動)

キャピラリー電気泳動：分類 キャピラリーゲル電気泳動 支持体：あり(ポリアクリルアミド、アガロース等) 泳動の駆動力：静電引力 泳動速度：分子ふるい効果(大きな分子が遅い) キャピラリー中のゲル電気泳動

キャピラリー電気泳動：分類 ミセル動電クロマトグラフィー 泳動液：イオン性ミセル添加電解溶液 泳動の駆動力：電気浸透流(ミセルの泳動は遅い) 泳動速度：ミセル相と水相との分配平衡 ミセル相に取込まれやすい化合物の泳動が遅れる

キャピラリー電気泳動：応用 DNA塩基配列解析(シーケンシング) キャピラリーゲル電気泳動 どちらか不明 キャピラリーゾーン電気泳動 生命科学(ゲノム配列解析)を飛躍的に進めた装置

電気泳動とは ある溶液に直流電流を流したとき、荷電粒子が自分の 電荷と反対の極に向かって移動する現象 直流電源 (パワーサプライ) 陰極 (anode) 陽極 (cathode) − + − − + + − + 泳動現象(力)の源：電場との相互作用 (+と−が引きあう)

電気泳動 電気泳動装置(ポリアクリルアミドゲル) パワーサプライ(電源装置) 出典 Wikipedia「ポリアクリルアミド電気泳動」 出典 http://www.tech-jam.com/campaign/budget/bio_10.phtml

ポリアクリルアミドゲル ポリアクリルアミドゲル ポリアクリルアミドゲル化学構造 出典: http://www-mls.tsurumi.yokohama-cu.ac.jp /stbiol/protocols/SDS_PAGE.pdf ポリアクリルアミドゲル化学構造

ポリアクリルアミドゲル/アガロースゲル アガロースゲル ポリアクリルアミドゲル ポリマー(長鎖化合物)がからまって固まったもの 電荷が同じなら − ゲルの網目を抜けでる速さ >> 分子ふるい効果 分子量の小さな分子が早く 泳動される ゲルろ過と逆 分子量が同じなら電荷の大 きな分子が早く泳動される +

電気泳動速度 移動速度 v: 移動速度; μ: 移動度; V: 電圧; L: 電極間距離; E: 電場強度 移動度 Q: 化合物電荷; π: 3.14•••; η: 溶媒粘度; r: 化合物半径 化合物半径 r ↑ 移動度 μ ↓ (μ ∝ 1/r) 化合物が大きくなると、泳動速度が遅くなる 化合物電荷 Q ↑ 移動度 μ ↑ (μ ∝ Q) 溶媒粘度 η ↑ 移動度 μ ↓ (μ ∝ 1/η)

ポリアクリルアミドゲル/アガロースゲル: 応用 核酸の鎖長決定 (プラスミド等) 核酸の鎖長決定 蛋白質の分子量決定 蛋白質の等電点決定 − − 核酸−蛋白質の結合定数決定 疎水性コア 蛋白質の構造形成原理 − + −

SDS-PAGE (蛋白質の分子量決定) SDS-PAGE 負電荷 − SDS: sodium dodecyl sulfate (界面活性剤) 　　 別名：ラウリル硫酸ナトリウム = = 蛋白質の変性剤 PAGE: PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 　　　 (ポリアクリルアミドゲル電気泳動) 長鎖脂肪鎖 (疎水性) − − − − − − − − − 蛋白質側鎖 − 蛋白質主鎖 蛋白質の構造を崩す 分子量に依存した長さ(大きさ) 鎖長に応じた泳動度 蛋白質の分子量決定

演習 化合物(a)〜(c)のうち、四角で囲んだ化合物と「キラル固定相法」 「キラル移動相法」等の光学分割が必要な化合物と、通常カラム (b) (c) CH3 H OH Cl CH3 H HO Cl CH3 Cl H OH CH3 Cl HO H S * * * * R S R S * * * * R 光学分割が必要な化合物： 通常カラムで分離可能な化合物：

宿題(締切: 6/18(木)，田中の部屋の前のカゴ) 分子(a)〜(c)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。 (a) 電荷価数: -5, 半径: 9 nmの球 (b) 電荷価数: -1, 半径: 3 nmの球 (c) 電荷価数: -2, 半径: 60×10-10 mの球 分子(d)〜(f)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。 ただし球状蛋白質の密度は全て同じで、蛋白質は完全な球体 であるものとする。 (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 (e) 電荷価数: -4, 分子量: 12000の球状蛋白質 (f) 電荷価数: -6, 分子量: 15000の球状蛋白質

宿題(締切: 6/18(木)，田中の部屋の前のカゴ) 分子(a)〜(c)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。 e: 電子1個の電荷 -1.602×10-19 (C) (a) 電荷価数: −5, 半径: 9 nmの球 (5e) 5e 移動度 = = 6πη×9 54πη クーロン (b) 電荷価数: −1, 半径: 3 nmの球 (1×e) e 3e 移動度 = = = 6πη×3 18πη 54πη (c) 電荷価数: −2, 半径: 60×10-10 mの球 60×10-10 m = 6×10-9 m = 6 nm (2e) e 3e 移動度 = = = 6πη×6 18πη 54πη 答　(a) > (b) ≈ (c)

宿題(締切: 6/18(木)，田中の部屋の前のカゴ) 分子(d)〜(f)の、電気泳動での移動速度の順番を答えなさい。 ただし球状蛋白質の密度は全て同じで、蛋白質は完全な球体 であるものとする。 単位(C) 移動度 単位(m) (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 単位(g/mol = g•mol-1) 分子1 molの質量 分子量 ≠ 半径 ( r に分子量を代入してはダメ!) ただし、分子量と半径 r には一定の関係がある(関数関係) 分子量 → 半径 の変換が肝！ 蛋白質1個の質量 = 分子量／アボガドロ数 (NA) = 9000/NA (g)

単位(C) 移動度 単位(m) (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 単位(g/mol = g•mol-1) 分子1 molの質量 分子量 ≠ 半径 ( r に分子量を代入してはダメ!) ただし、分子量と半径 r には一定の関係がある(関数関係) 分子量 → 半径 の変換が肝！ 蛋白質1個の質量 = 分子量／アボガドロ数 (NA) = 9000/NA (g) 蛋白質1個の体積 =蛋白質1個の質量／密度 (a (g/m3)) = {9000/NA (g)}/a (g/m3) 9000 = (m3) NA•a 4πr3 蛋白質1個の体積 = (m3) (球の体積の公式) 3

√ √ 単位(C) 移動度 単位(m) (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 単位(g/mol = g•mol-1) 分子1 molの質量 9000 4πr3 蛋白質1個の体積 (m3) = = NA•a 3 4πr3 NA•a 9000 (球の体積の公式) = 3 3×9000 27000 r3 = = 4πNA•a 4πNA•a √ 3 27000 √ 3 1 r = = 30 4πNA•a 4πNA•a

√ √ √ √ √ √ √ √ √ √ (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 27000 1 r = = 30 (m) 4πNA•a 4πNA•a (e) 電荷価数: -4, 分子量: 12000の球状蛋白質 √ 3×分子量 √ 3×12000 √ 36000 √ 3 3 3 3 36 r = = = = 10 4πNA•a 4πNA•a 4πNA•a 4πNA•a (m) (f) 電荷価数: -6, 分子量: 15000の球状蛋白質 √ 3 3×分子量 √ √ √ 3 3×15000 3 45000 3 45 r = = = = 10 4πNA•a 4πNA•a 4πNA•a 4πNA•a (m)

√ √ √ (d) 電荷価数: -5, 分子量: 9000の球状蛋白質 Q μ(d) = 6πηr = 6πη r 1 5e 27000 4πNA•a √ 3 e 53×4πNA•a 54 πNA•a (e) 電荷価数: -4, 分子量: 12000の球状蛋白質 μ(e) = Q 6πη r 1 4e = 36000 4πNA•a √ 3 e 140.6 πNA•a (f) 電荷価数: -6, 分子量: 15000の球状蛋白質 μ(f) = Q 6πη r 1 6e = 45000 4πNA•a √ 3 e 52.08 πNA•a 答: (f) > (d) > (e)

ポリアクリルアミドゲル: 応用 アガロースゲル ポリアクリルアミドゲル 核酸の鎖長決定 (プラスミド等) 核酸の鎖長決定 蛋白質の分子量決定 蛋白質の等電点決定 − − 核酸−蛋白質の結合定数決定 酸性アミノ酸 塩基性アミノ酸 蛋白質の荷電状況 − + −

等電点：アミノ酸基礎データ アミノ酸名 構造式 等電点 (pI) 酸性アミノ酸 側鎖 塩基性アミノ酸 アスパラギン酸 Asp (D) 2.98 グルタミン酸 Glu (E) 3.22 側鎖 アルギニン Arg (R) 塩基性アミノ酸 10.8 リジン Lys (K) 9.74 ヒスチジン His (H) 7.59

ポリアクリルアミドゲル: 等電点電気泳動 蛋白質の等電点 (pI) 決定 − COO NH3 + − COO NH2 COOH NH3 + pH < pI pH = pI pH > pI 溶液のpHが等電点 (pI) と等しい時、+/−の電荷が釣り合って 蛋白質分子の電荷の総和が “0”になる (= 電場の力を受けなく なる)。→ 電場中を泳動しない（ゲル中を移動しなくなる）

電気泳動とは ある溶液に直流電流を流したとき、荷電粒子が自分の 電荷と反対の極に向かって移動する現象 直流電源 (パワーサプライ) 陰極 (anode) 陽極 (cathode) − + − − + + − + 泳動現象(力)の源：電場との相互作用 (+と−が引きあう)

ポリアクリルアミドゲル: 等電点電気泳動 −に帯電 − COO − pH > pI NH2 陽極方向 に移動 pH − pH = pI (パワーサプライ) 直流電源 − COO NH3 + pH = pI + 電荷の総和が “0” になる 電場の引力が “0” になる ゲル中の移動が止まる

問題 1. ：解答 (1) 質量分布比（保持比）kの定義式を書きなさい。（ヒント：クロマトグ ラムの保持時間 (tRA, tRB) を含まない式） (2) ピークAの化合物の質量分布比（保持比）kをクロマトグラムの保 持時間を含む形の式として表しなさい。 答 (1) (2) (3) (1)の定義式に基づいて、kが大きくなると化合物の保持時間が 長くなることを説明しなさい。ただし、流速は変えないまま、kのみ が変わるものとする。 kが大きくなるということは、固定相に存在する量がより増えて、 移動相に存在する量が減ることを意味する。 その結果、カラム に結合する時間が長くなり、溶出するまでの保持時間が長 くなる。

問題 1. ：解答 (4) (2)の式に基づいて、kが大きくなると化合物の保持時間が長くな ることを証明しなさい。 より t0•k = tR − t0 整理して tR = t0•k + t0 t0 > 0 のため、kについて単調増加の一次関数 よって、kが大きくなるとtRが増加 = 保持時間が長くなる (5) ピークAとピークBの分離度RSを式で表しなさい。 分離度 (6) ピークAの化合物の保持容量VRAを求めなさい。移動相の流速 を2 mL/minとする 。 保持容量 VRA = tR•F = 2(mL/min)•tR(min) = 2tR mL

問題 1. ：解答 (7) 理論段数Nの定義式を書きなさい。。 理論段数 (8) (7)の定義式に基づいて、理論段数が大きくなるとピーク同士の 分離能が上がることを証明しなさい。 (7)の定義式より理論段数が大きくなる時は W0.5h2 が小さくな る(=W0.5h が小さくなる)。 分離度 の W0.5hA と W0.5hB が小さくなる tRA, tRBは一定(定義し忘れでごめんなさい)のため、分離度の定義 式の分母のみが小さくなる。 よって、理論段数Nが大きくなると、ピークの分離度Rsが良 くなる

問題 1. ：解答 (9) 上図のクロマトグラムを与えるカラムの理論段数が80であった時、 理論段数が320になった場合のクロマトグラムを下記のクロマトグ ラムに重ねて書きなさい。ただし、各ピークの保持時間は変化し ないものとし、同量の化合物をカラムに注入することとする。 理論段数 より、W0.5h2 = 5.54tR2/N W0.5h = (5.54tR2/N)(1/2) = tR(5.54/N)(1/2) 半値幅は√Nに反比例 理論段数が4倍になると半値幅は 1/2 化合物量一定: ピーク面積不変: 高さが2倍

問題 1. ：解答 (10) カラムの理論段数が80でカラム長が150 mmであった時、理論段 高さHを求めなさい。 理論段高さ = 150(mm)/80(無次元) = 1.875 mm

問題 2. ：解答 次のピークA, Bの分離度、ピークAのテーリング(シンメトリー)係数・ 保持時間tRAを求めなさい。 分離度 9.5(cm) − 5.5(cm) Rs = 1.18 × 1.5(cm) + 0.8(cm) Rs = 2.0521••• ≈ 2.1 S = W0.05h 2f = 1.9(cm) 2×1.1(cm) = 0.863••• ≈ -0.86 リーディング チャートスピード 20 mm/min とすると(定義し忘れてごめんな さい)、tRA = 55(mm)/20(mm/min) = 2.75 min

問題 3. ：解答 (1) シリカゲルを用いたクロマトグラ フィーで溶離溶媒として酢酸エチ ルから始め，次第にメタノールの 量をステップワイズ（段階的に）に多くしていき，最後にはメタノー ルのみにした．このとき，３つの物質がどのような順序で溶出され るか．そしてその理由を述べよ。 溶出順： (c) → (b) → (a) 理由： シリカゲルは、表面にシラノール基(Si-OH)が存在し、 高極性となっている。従って、極性の高いものほど遅く溶出 する（= 極性の低いものから溶出する）。(A)には水酸基が あり最も高極性。(B)(C)でな(C)にアルケンが結合しており、 (B)より低極性。よって極性が低いものから順に(c) → (b) → (a)となり、これが溶出順となる。

問題 3. ：解答 (2) 溶媒組成を変化させて化合物の溶出をさせる方法を何と呼ぶか。 グラジエント溶離法 (3) シリカゲルを固定相に用いたクロマトグラフィーの分離メカニズム を答えなさい。 吸着クロマトグラフィー (4) シリカゲルを用いたクロマトグラフィーのような溶出順となるクロマ トグラフィーを何と呼ぶか答えなさい。 順相クロマトグラフィー (5) シリカゲルを用いたクロマトグラフィーとは、化合物が溶出する順 序が逆転するクロマトグラフィーを何と呼ぶか答えなさい。溶出順 による分類名で答えること。 逆相クロマトグラフィー

問題 3. ：解答 (6) (4)の分類に属するクロマトグラフィーに用いられる固定相の以下 から選びなさい。 ポリエチレングリコール(PEG) b) オクタデシルシリル基 c) アルミナ d) セファデックス e) ケイソウ土 f) アミノプロピル基 答: a), c), d), e), f) (7) シリカゲルを用いたクロマトグラフィーのような溶出順となるクロマ トグラフィーを何と呼ぶか答えなさい。 順相クロマトグラフィー (5) シリカゲルを用いたクロマトグラフィーとは、化合物が溶出する順 序が逆転するクロマトグラフィーを何と呼ぶか答えなさい。溶出順 による分類名で答えること。 逆相クロマトグラフィー

等電点：意味 等電点 (pI) において、各アミノ酸の+/−の電荷が釣り合う 溶液のpHが化合物のpIと等しくなると 分子内の +の電荷 = −の電荷 電荷の総和が“0” 等電点 (pI) の概念は pKa に似ている 溶液のpHが化合物のpKaと等しくなると プロトン化体濃度 = 脱プロトン化体濃度 HA + H2O → A− + H3O+ [HA] = [A−]

等電点：pKaとpH (1) K: 平衡定数 CH3CO2H + H2O CH3CO2− + H3O+ [CH3CO2−] [H3O+] K = [CH3CO2H] [H2O] [CH3CO2−] [H3O+] K [H2O] = [CH3CO2H] ここで K [H2O] = Ka と置くと [CH3CO2−] [H3O+] Ka = [CH3CO2H]

等電点：pKaとpH (2) K: 平衡定数 CH3CO2H + H2O CH3CO2− + H3O+ [CH3CO2−] [H3O+] = [CH3CO2H] 両辺の対数をとって、−1をかけると [CH3CO2−] [H3O+] −log Ka = −log [CH3CO2H] [CH3CO2−] [H3O+] −log Ka = −log [CH3CO2H] [CH3CO2−] −log Ka = − log + log [H3O+] [CH3CO2H]

等電点：pKaとpH (3) CH3CO2H + H2O CH3CO2− + H3O+ K: 平衡定数 [CH3CO2−] −log Ka = − log + log [H3O+] [CH3CO2H] [CH3CO2−] −log Ka = − log − log [H3O+] [CH3CO2H] −log [H3O+] = pH, −logKa = pKaを代入し、右辺と左辺を入替ると [CH3CO2−] [CH3CO2−] pKa = − log + pH − log + pH = pKa [CH3CO2H] [CH3CO2H] [CH3CO2−] Henderson-Hasselbalchの式 の酢酸バージョン pH = pKa + log [CH3CO2H]

pKaとpH: Henderson-Hasselbalchの式 CH3CO2H + H2O CH3CO2− + H3O+ K: 平衡定数 [CH3CO2−] Henderson-Hasselbalchの式 の酢酸バージョン pH = pKa + log [CH3CO2H] [CH3CO2H] = [CH3CO2−]の時 [CH3CO2−] [CH3CO2H] log = log = log 1 = 0 [CH3CO2H] [CH3CO2H] よって[CH3CO2H] = [CH3CO2−]の時、pH = pKa 裏を返すと pH = pKaの時、[CH3CO2H] = [CH3CO2−] プロトン化体濃度 = 脱プロトン化体濃度 即ち、半分が脱プロトン化している