物語 バラバラだった大腸菌が・・・ 一か所に集まり・・・ Ｖｖ しだいに大きくなり・・・ 有限の大きさで止まります。

私たちのプロジェクトに必要なもの ●大腸菌同士の吸着 →鞭毛にヒスタグを挿入 ●大腸菌の一か所への集合 →クオラムセンシング ●大腸菌の集合体の大きさの制御 →AHLクエンチャー

SENDER tetR LuxI tetR FliC-His ・常にAHLを生産する。 ・常にヒスタグ付きの鞭毛を生やす。

RECEIVER tetR LuxR aiiA pLux GFP pLux FliC-His ・常にaiiAを発現する。 ・AHL存在下でGFPを発現する。 ・AHL存在下でヒスタグ付きの鞭毛を生やす。

DESIGN Receiver Sender Senderは常にAHLを生産します。

DESIGN Senderが生産したAHLが届く範囲にいるReceiverはGFPを発現し、ヒスタグ付きの鞭毛を生やします。

DESIGN ヒスタグ付きの鞭毛が生えたReceiverはニッケルイオンを仲介としてSenderの周りに吸着します。

DESIGN ReceiverはaiiAを発現してAHLを分解します。 AHLが届く範囲が狭まり、鞭毛が生えるReceiverが制限され大腸菌の集合体の大きさが制限されます。

FliC-System ・FliCとはE.coli の鞭毛の主要な 構造タンパク質 ・非必須ドメインを 鞭毛の外側に 露出している。 　露出している。 ・FliCの非必須ドメインに、任意の 　タンパク質を　、鞭毛の機能を損 　なうことなく挿入することができる。

Histagged-FliC

Histagged-FliC

His-Tagged-FliC

His-Tagged-FliC

His-Tagged-FliC ・E.ColiはHistag-金属イオン作用 　により互いに吸着する。

His-Tagged-FliC ・E.ColiはHistag-金属イオン作用 　により互いに吸着する。

Phenotype check 転写 ① ④ ⑧ pET-49b M ⇒FliC-Hisの発現が確認された。

Beads adsorption 原理 ・

Beads adsorption RM培地 5mL ビーズ吸着 30℃ IPTG5μL Colony Check inculate 顕微鏡

Beads　adsorption ・Colony Check　　　　　　　　　　　　　　　　　　・顕微鏡写真 No Metal 顕微鏡写真 No plasmid

Toxicity Check and Cell aggregation RM培地 5mL Add Ni2+ Co2+ (Stationary) 30℃ IPTG5μL Colony Check inculate 顕微鏡

Toxicity Check and Cell aggregation 顕微鏡写真

Sender aggregation RM培地 5mL Add Ni2+ Co2+ (Stationary) 30℃ IPTG5μL 顕微鏡

Sender aggregation ・ 顕微鏡写真

Receiver aggregation RM培地 5mL Add Ni2+ Co2+ (Stationary) 30℃ IPTG5μL 顕微鏡

Receiver aggregation ・ 顕微鏡写真

Quorum Sensing System LuxI and LuxR aiiA SenderとReceiverの選択ができるようにする Sensitive Normal aiiA Receiver Strong(Super Sender) Normal

Quorum Sensing System LuxI and LuxR aiiA SenderとReceiverの選択ができるようにする Sensitive Normal aiiA Receiver Strong(Super Sender) Normal

aiiA inverter Receiver LuxR GFP aiiA pTet pLux cI inverter Low AHL High AHL GFP aiiA

Senderの数とGFP発現 Sender:5×10^8～5×10 Receiver Sender(BW25113 or XL10G), Methionine (10mM or 0mM) Sender:5×10^8～5×10 methionine S-adenosyl methionine 3OC6HSL(AHL) metK LuxI Methionine 0mM Methionine 10mM BW25113 5×10^4 XL10G 5×10^7

AHL synthesis Sender:5×10^8～5×10 S-adenosyl methionine methionine metK AHL synthesis LuxI, acyl-ACP 3OC6HSL Receiver Sender(BW25113 or XL10G), Methionine (10mM or 0mM) Sender:5×10^8～5×10

super receiver luxR ・AHLの感度をあげるためLuxRの４５番目のIをFに変えた、mutantをつくった。 I45F Normal receiver ｍ

super receiver test sender sender Super Normal 　　現在テストに向けて進行中

super receiver test２ ・左図のようなチューブにsuper、normalともに同じ量ずつ入れていく。 ・加えるsenderまたはAHLの量をだんだんと増やしていき、superとnormalの発光の違いを観察する。　 ・こんな実験ができたらいいなと進行中。 super normal

Final-Construction

Final-Construction 実験 鞭毛間吸着テスト（senderとreceiver同士が吸着するか確認） マリモがちゃんと形作れるかテスト サイズの制御テスト

Absorption Test

How to make Marimo R R Receiver O/N Culture R R Ni2+ R R R R R

How to make Marimo 1滴 S S S R R Receiver AHL R O/N Culture R Ni2+ R R

How to make Marimo S S S R R R R Receiver O/N Culture R AHL S Ni2+ R S

How to make Marimo S S S R Receiver O/N Culture R R R AHL R S Ni2+ S R

How to make Marimo S S S R Receiver O/N Culture R R R AHL R S Ni2+ S R

How to make Marimo MARIMO! S S S R Receiver O/N Culture R R R AHL R S Ni2+ S R S R R R R R MARIMO!