iGEM Chiba 2009 E.coli Time Manager Since 2008 Good morning everyone. Thank you for coming to our presentation. We start the presentation of our project, “E. coli Time manager.” E.coli Time Manager Since 2008

ヒトが時間を知る方法 周期的振動型 累積型 掛け時計・腕時計 “今”が何時なのか、という瞬間を知る方法 水時計・砂時計 秒は、セシウム１３３の基底状態の2つの超微細構造準位の間の遷移に対する放射の周期の9 192 631 770 倍の継続時間である。 ---------------- 人が時間を知る方法は大きく分けて２つあります。 There is two ‘’time’’we want to know. 1つは、掛け時計・腕時計に代表されるような「今が何時なのかという瞬間を知る」方法です。 First, we can read WHEN it is now from clock or watch. 2つめは、水時計や砂時計に代表されるような「過去のある時点から現在までの 経過した時間の累積を知る」方法です。 Second, we can get HOW LONG it has passed with timer. --------------------------------------- 過去のある時点から現在までの 経過した時間の累積を知る方法

それぞれの時計のメリットとデメリット 「周期的振動型」：掛け時計・腕時計 「累計型」：水時計・砂時計 （07, 08Paris） （08Melbourne） メリット 「今何時か」という瞬間の時間を知ることに特化している 経過した時間の長さを知る場合 ある時間からある時間までを頭の中で計算する デメリット 「累計型」：水時計・砂時計 07Missouri/08Chiba, 08Taipei これらは２つの時計のメリットについて、考えると Think about the advantages and disadvantages of the clock and timer. 瞬間型時計は“今何時なのか”といういわばその“瞬間”の時を知ることに特化しており、 また、累計型時計は“時の経過”を知ることに特化しているといえる。 The clock (or watch) specialize in telling WHEN it is. So to know how long it has passed, we must use subtraction. On the other hand, the timer specialize in telling HOW LONG it has passed. And it is hard to know WHEN it is from timer. しかし今紹介した、これらのメリットは、お互いのデメリットでもある。 例えば、瞬間型時計でも、時の経過を知ることは可能であるが、その場合は私たち観測者側が 自分で計算をすることによってはじめて、その経過時間をしることができる。 ある定まった時間の経過を知るだけならば、水時計・砂時計を代表するような累計型の時計が向いていると言える。 逆に、その場その場の“瞬間的”な時間を累積型時計で知ることも可能ではある。 しかしそれこそ、ある時からのトータルの時間を計算しなければならず、目的の時間（しかもその場の一瞬の時間）を知るためには時間がかかると言える。 つまり、瞬間型時計・累積型時計のそれぞれのメリットは、お互いのデメリットであるといえる。 過去のigemの時計プロジェクトを見ると、07-08Parisと08メルボルンは瞬間型時計に、 また、07ミズーリマイナーズ,08NYMU-Taipei、および、08Chibaは累積型時計に挑戦している。 07-08Paris and 08 Melbourne tried to create the CLOCK. 07 Missouri, 08 Taipei, and 08 Chiba attempt to make the TIMER. 次のスライドから、この累積型時計に注目したプロジェクトを簡単に説明する。 From next slide, we will explain the project about the TIMER of those teams simply. --------------------------------------- メリット 特定の長さの時間の経過を知ることに特化している デメリット 時間の流れをつくることができない

具体例1： ’0７ Missouri Miners Arabinose Time ・シンプルな回路デザイン 優位点 アラビノース量で計る時間を調節するので、 遺伝子をいじらなくても簡単にダイナミックレンジを調節することができる。 シンプルなため、トラブルを起こしづらい？ ・アラビノースの存在下で、GFP発現を抑制する機構を使っているので 培地中の濃度のゆらぎによる漏れがでやすい。 ・一つの培地では一種類のタイマーしか動かせない First, about Missouri Miners’ project, this system Advantage: This system is very simple, so it is thought that this is secure. The dynamic range depends on Arabinose, so it is easy to make many variety of timers. Disadvantage: To activate the reporter, this team use the repressor of the other repressor that inhibit expressing the reporter protein. This may cause the confusion of threshold. Only one variety of timer allowed to be functional in one medium. --------------------------------------------- まず、最初に具体例として2007年のミズーリマイナーズを紹介する。 このチームは、アラビノースの存在下でGFPを発現しない回路を組み込み、 系中のアラビノースが代謝されきると、GFPを発現させるシステムをつくった。 この代謝される時間が、このシステムが計ることのできる時間である。 例えるなら、砂時計の様なシステムであるといえるだろう。 このシステムの優位点は、回路がとてもシンプルであることだ。 また、系中に入れるアラビノース量で計る時間を調節するので、 課題としては、抑制機構を使っているので、系中のアラビノース濃度の揺らぎによって出力が入る時間が個体間でずれてしまう点があげられる。 また、一つの系では一種類のタイマーしか動かせないという問題もある。 ・シンプルな回路デザイン ・簡単なダイナミックレンジの調節 優位点 課題 ・抑制を使っているので、スイッチの入りが鈍い。 （系中の全ての個体の同時制御が難しい。） ・一つの培地では一種類のタイマーしか動かせない

具体例2： ’08 CHIBA AHL Time シグナル分子の蓄積を利用するので、過去の情報を記憶するといった 優位点 ------------------------------------------- Ｇｏｏｄ 同一系内で複数のタイマーを動かせる可能性があった？ シグナル分子の蓄積を利用するので、過去の情報を記憶するといった 積分系への発展など、その他の応用例が考えられる。 課題 クロストークによる応答の差があまりに大きかったため 実際にはほとんど反応が見られなかった 多くのバリエーションを作れる余地を持ったアイデアだったが 実際には種類が少ない --------------------------------------------- ＧＦＰは比較的安定とのことなので、これこそが積分系への発展の可能性となるのではないか 入力をＡＨＬに変換して放出することで入力の情報を集団で共有している形になる ここに何か利点ないかな？　野澤 シグナル分子の蓄積を利用するので、過去の情報を記憶するといった 記録装置などの応用例が考えられる。 優位点 ・GFPの蛍光強度の変化を見る限り、AHLの蓄積ではなくて 　GFPの蓄積で時間を計っているようにも考えられる。 ・一つの培地では一種類のタイマーしか動かせない。 課題

具体例3： ’０８ NYMU-Taipei Time Cll ・周期的な出力と通信の組み合わせによって、 Second we will explain about the system of 08 NYMU-Taipei’. このチームは周期的に、シグナル分子を出し、そのシグナル分子がある値に溜まると、スイッチが入るという いわば、ししおどしwhich　is Japanese 水時計!! のようなシステムを作った。 This team has created the system like Shishiodoshi which is Japanese water timer. E.Coli generate signal molecules, and after a while, when the accumulation of signal molecules exceeds the threshold, the function of reporter switches on. このシステムはまず周期を合わせるための菌同士の通信と、水時計の水にあたるシグナル分子が分けてあり、 システムが完成すれば、この通信の組み合わせの仕方によって、ダイナミックレンジの調節ができることが優位点である。 また、断続的にシグナル分子を出力することから、超時間（16-40h）の時間計測が可能というのも魅力的だ。 In this system, the signal molecule for Quorum Sensing is separated from that for switching on the promoter. Change the expression of both of two molecule, they can adjust the dynamic range of this system. 課題としては、周期を合わせるために使うAHLとＬｕｘＲとの結合の平衡が閾値応答であるため、シンクロするのには時間がかかることがあげられる。 It is the problem that it takes some time to complete synchronizing the action of bacteria. Because the balance between the concentration of AHL and that of LuxR reflects threshold-based reaction. ----------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------- Wiki等にあるグラフは理想的なもの？ →理想と比べると去年の千葉のデータはふらついているように見えるけど、それを利点としてよいのだろうか 複雑さによる負担の大きさに関してはソースがない 勝手な想像です　野澤 ・周期的な出力と通信の組み合わせによって、 　ダイナミックレンジの調節が可能である。 ・長いダイナミックレンジ（16-40h） 優位点 課題 ・細胞の周期をシンクロさせることが困難

これまでのiGEMでの課題と ’09 CHIBAの目標！ これまでのタイマープロジェクトのどれもが、 精確性と、時間の流れが弱点である。 このスライドの前の時点で、これまでのタイマープロジェクトのどれもが、精確性と、時間の流れが弱点である、 -------------------------------- 個人的には微調整というのも非常に大切だと思う というか調べたいことがたくさんあるけどそこはスライドに書くことではない　野澤 ・[ＡＨＬ]＋[ＬｕｘＲ]⇔[ＡＨＬ-ＬｕｘＲ]の平衡の部分にあるという（冨永さん談）閾値の精確な値 ・ＡＨＬの蓄積速度 この辺は調べればシグモイドカーブを作るために役立つ可能性があるかと思います。 ０９CHIBAは精確性と流れのあるTime Managerをつくる！

精確性を向上させるには シグナル分子濃度が閾値を越えたときから、レポータによる色調変化が観察されるときまでのTime Lag を解消する必要がある。 Time lag Time lag Visible zone　 私たちは蛍光強度対時間のグラフをシグモイダルにすることによって、立ち上がりから肉眼での判断が可能となるまでの時間を短縮することが出来ると考えました。 シグモイダルなグラフの方がコントラストがはっきりつくため、閾値を超えたことを認識しやすくなるからです。 （つまり、ONとOFFの差をはっきりさせることが精確性の向上に貢献すると考えた） スライドをご覧ください。 左側のグラフが昨年の千葉チームの作成したタイマーの蛍光強度対時間のグラフ、右側が今年の千葉チームが目指すグラフです。 左側のグラフに比べ、右側のグラフでは閾値の前後で蛍光強度にはっきりとした差が見られます。 すなわち右側のようなグラフを描くことのできる菌を使えば、観察している人間はより明確に閾値を超えたことを認識できるということではないでしょうか。 以上の理由から私たちは精確性の向上のために蛍光強度対時間のグラフをシグモイダルにすることを目指します。 Visible zone　 Concentration of AHL ≒ Time Concentration of AHL 　 　　≒Time

時間を精確に刻ませるための 具体的なアイデア 1, Positive feedback system This system can produce AHL and increase express GFP gene 2, Check about AHL accumulation rate and the threshold level 3, グラム陽性菌のコミュニケーションの利用 Com系のものでの差＝ペプチドタイプのクオラムセンシングは遅い。 次に精確に時間を刻ませるための具体的なアイディアについてお話します。 私たちは精確性を向上させるための手段として、ポジティブフィードバックを提案します。 ポジティブフィードバックシステムでは入力（AHL）が少量でも、系中で入力シグナルを増幅することにより出力（GFP）の量を増幅することができます。 このシステムを用いれば、蛍光強度対時間のグラフが先ほどのスライドでご紹介したシグモイダルなものに近づけると考えています。 Next, we will explain the concrete idea for making sigmoid curve. We float the Positive Feedback System. We expect that using this system contribute to making. -----------------------

精確性の向上のためのアイデア： Using positive feedback system Ptet luxR LuxI LuxI Plac LuxI luxR luxR Plux GFP luxI ここでポジティブフィードバックシステムについて入力をAHL、出力をGFPとして説明します。 スライドをご覧ください。 まず、右側の図、上側のtetプロモータの起動によって発現したluxRは、左側の図のlacプロモータの起動によって発現したLuxIが産生するAHLと複合体を形成します。 この複合体は右側の図、下側のluxプロモータを起動します。 そうすると、下流に組み込まれたGFPとluxIが発現し、luxIはAHLを産生します。 ここで産生されたAHLはluxRと複合体を形成し、luxプロモータを起動する、という流れになります。 このシステムの利点は少しの入力であっても出力を増幅することによって閾値を見やすくできる点です。 なお、このアイディアは2007年のケンブリッジチームのプロジェクトから引用しました。 ------------------------------------------------- ポジティブフィードバックの利用 このシステムはAHLを生産し、GFPの発現を増幅させることができる。 (以下、要議論) しかし私たちの使いたい回路はAHLに関係しているので、このシステムはあまり向いていないんじゃないだろうか。 But we want to use circuit with AHL , because this system may be not suit so much. The positive feedback system can produce AHL and increase express GFP gene. ‘07 Cambridge

時間の流れをつくるには 直列型 並列型 ここでもう１点問題になってくるのは、どのように時間の流れを作るかです。 私たちは、時間の流れを作る方法として「直列型」と「並列型」の２種類を考えました。 「直列型」では、スライド左側の図のようにある入力を受けた回路が新たなシグナルを出し、それを受け取った回路がまた次のシグナルを出すという行為を繰り返すことで時間の流れを作ろうという案です。 A→B→C→D→E この案の利点は一つの系で多種の出力ができる点です。 例えば一番左側の回路にはGFP、真ん中の回路にはRFP、右側の回路にはYFPを組み込んでおけば、１回入力するだけで３色の蛍光が観測できます。 一方この案の欠点は１つが駄目になるとそこから下流の回路が発現しない点です。 この案のシステムを考えれば明白なことですが、全ての回路は自身の１つ上流の回路の出力を自身の入力として起動するため、１つでも出力できない回路があるとそこから下流の回路は起動できなくなってしまいます。 「並列型」では、スライドの右側にあるように、全ての回路が同じ入力で起動し、それぞれが違う出力をすることで時間の流れを作ろうという案です。 A→B A→C A→D A→E この案の利点は、どこかの回路が駄目になっても「直列型」のように止まらず、最後までそれぞれの回路が発現できるという点です。 例えばスライド右側の図の真ん中の回路が止まってしまったとしても、他の回路は起動しておりそれぞれの出力をすることができます。 一方この案の欠点は順番通りに発現できない可能性があるという点です。 それぞれの回路が個別に起動するため、A、B、Cの順に発現させたいとき、AからBが発現する回路とAからCが発現する回路の順番が入れ替わってしまう可能性があります。

時間の流れをつくるための 具体的なアイデア 1, 直列回路： (Ⅰ) Whisper down the lane system Using Cascade of Quorum Sensing (Ⅱ) Pass the torch system Using Cascade of inside the cell 2, 並列回路： Lux Mutants to make variations in delay time is to create 　　　a number of LuxR mutants with different sensitivity 次に時間の流れを作るための具体的なアイディアについてお話します。 私たちは時間の流れを作るための手段として、「直列型」として伝言システム、「並列型」としてLux変異体を使ったシステムの２種類を提案します。 伝言システムは「直列型」の原理をそのまま利用しています。 Lux変異体を使ったシステムは、luxRを敏感なもの、自然のもの、鈍感なものの３種類を用いて時間差を作ることで「並列型」の原理を応用しています。

流れをつくるためのアイデアその１： Whisper down the lane Using the cascade of our bacterial communication, we make the system like the whisper down the late. Delayed More Delayed 次に時間の流れを作るための具体的なアイディアについてお話します。 私たちは時間の流れを作るための手段として、「直列型」として伝言システム、「並列型」としてLux変異体を使ったシステムの２種類を提案します。 伝言システムは「直列型」の原理をそのまま利用しています。 Lux変異体を使ったシステムは、luxRを敏感なもの、自然のもの、鈍感なものの３種類を用いて時間差を作ることで「並列型」の原理を応用しています。 ----------------- 今までは異種間のコミュニケーション、クロストークを利用していましたが 今回は逆にクロストークを行わないクオラムセンシングの組み合わせを利用して２段階の通信リレーを作ります。 まず入力をA号機が受信し、B号機だけが感知できるシグナル（AHL）を出します。 B号機はレポーター機にのみ感じられるシグナルを出します。 去年の通信を２段階にすれば、さらなる通信の遅れを生み出すことができるのではと考えました。 ただ溶液中に複数のシグナルが飛び交う状態になるのと、そこまで長い時間、複数の種類の菌が同じ環境下で生きていられるのかはわかりません。 メリット 追越しがおこらない デメリット トラブルがあると途中で止まり最後まで着かない

LuxI Family Protein AHL Synthase Varieties 異なる生物は、アシル鎖の長さ、あるいはC-3位の置換基が異なる種類のAHLを合成する。Vibrio fischeriは3OC6HSLを、Pseudomonas aeruginosaはC4HSL、C6HSL、および3OC12HSLを合成する。LuxRはAHLのoxo-C6～C14-HSLとC6～C12-HSLまでのAHL構造を、LasRはAHLのoxo-C10～C14-HSLとC10-C12HSLという構造を、RhlRはAHALのoxo-C10～C14-HSLとC4～C12-HSLという構造をそれぞれ認識する。LuxRはVibrio fischeri由来であり、低濃度の3OC6HSLに対して(~5nM)、応答する。しかし、他種生物由来のAHLに対しては、より高い濃度でないと遺伝子発現が起こらないことが分かっている。AHL合成速度が十分に遅いならば、LuxRは、3OC6HSLに対して最も早く応答し、他のAHLに対してはそれよりも遅く応答する。

流れをつくるためのアイデアその2： LuxR mutant We think the most straightforward approach to make variations in delay time is to create a number of LuxR mutants with different sensitivity. luxR Sensitive luxR luxR Rapid Plux GFP Wild type LuxR luxR luxR Normal 次にLuxの変異体を用いたシステムについて説明します。 私たちはまず、感度の異なるLuxRを使えば容易に「遅れ」を作り出すことができるのではないかと考えました。 感度が高いほど応答までの時間は短くなります。 このシステムで得た時間差を利用して「並列型」の回路を作ります。 スライドの図では、敏感なもの、自然のもの、鈍感なものの３種を用いた場合を示しています。 このシステムの利点・欠点は「並列型」の回路と同じです。 - 元のメッセージを表示 - ------------ Probably, the most straightforward approach to make variations in delay time is to create a number of LuxR mutants with different sensitivity. We think the higher the sensitivity is, the shorter the delay time would be. The lower the sensitivity is, the slower the switch response should be. おそらく、時間を遅らせるバリエーションを作る最も簡単な方法は、異なった感度を持つLuxRの変異体をいくつか作ることです。 私たちは、感度が高ければ高いほど遅れは短くなると考えます。 感度が低ければ低いほど、スイッチの応答は遅くなるはずです。 AHL Plux GFP luxR Dyll luxR luxR Delay Plux GFP

’09 CHIBAの目標！ ０９CHIBAは精確性と流れのあるTime Managerをつくる！ １．精確性・・・・p-feedback そのために以下のことにトライします！ １．精確性・・・・p-feedback ２．流れ・・・・直列型（リレータイプ） 並列型（mutant）

昨年度は写真の通り、花の開花を見ることは できなかった・・・。 ‘08 ＣＨＩＢＡの 咲くことのなかった花 こうなる予定だった Last yearはここまで 去年は2段階のモノしか作れなかった。 昨年度は写真の通り、花の開花を見ることは できなかった・・・。

‘０９ＣＨＩＢＡは 大輪の花火を打ちあげます！ 割薬（わりやく）、割粉（わりこ） 芯星 親星 ちば ０９ 直列だと途中で止まってしまった部分があるとそれ以上広がれないが、並列ならば途中で止まってしまった部分があっても最後まで絵が広がることができる。 玉皮：一番外側にあり、玉詰め（星や割粉を玉皮のなかに並べる作業）をする際には半球状に分かれている。この図で言うと、上半分と下半分（導火線付き）に最初は分かれていて、材質は成形されたボール紙。古き昔は、球状の木型の周りに新聞紙を張り重ね、それを半分に切って作っていたそうだ。玉皮の中には、目的に応じた星や部品を配置していく。その後、玉のサイズ、種類に合わせた枚数だけのクラフト紙を貼っていく。丸い玉に貼るので、短冊状の紙を、極力重ならず、極力隙間が開かないようにして貼っていく。そして、数枚貼り重ねたら天日で干し、目的の枚数になるまでこれを繰り返す。玉貼りの途中で、導火線の反対側に竜頭（花火を吊るすための輪）を付ける。竜頭は、直接手で持ったり、紐や縄を付けて、玉を筒に入れる際に使用する。 割薬の芯は、米の籾殻、くず米、綿の実、コルクなどを、玉の大きさに応じて使い分けている。また、芯星の内側の割薬と、親星の内側の割薬には異なるものを使用している。 導火線：導（みち）、親導とも呼ばれ、花火の開花タイミングを決定するもの。花火玉の導火線は、打揚筒の中から打ち出される際に、筒の中の打揚火薬から二次的に点火される。花火玉は上空へ向かいながら導火線も燃焼し、上空で玉がちょうど静止した頃に、玉の中心の割薬に点火するように調整されている。 親星、芯星：星の構造は上図のように、ちょうどアメの変り玉のような構造をしている。菊用の星はこのように何色か使われているが、牡丹用の星は普通１色のみとなっている。一番の中心（芯）には菜種を使用するのが一般的で、水や火薬を溶いた水溶液で湿らせた菜種に、火薬の粉をまぶす。水分に見合った粉が付いたらまた湿らせて、火薬の粉をまぶす。この作業と天日干しを延々と繰り返して、数ｍｍの菜種が１０号玉用の親星だと約３ｃｍ位までの大きさにする。この作業を星掛けといい、途中で違う色に燃える火薬を掛けるので、空で色が変化するという訳。図の例だと、錦色で広がり、紅から緑に変化する。実際に空で燃える時は当然外側から燃えるので、星掛けは、空で出したい色変化の順とは逆の順で、色の火薬を掛けていく。図の例だと、菜種に緑、紅、錦の順で作業することになる。実際には、一番外側や、色の変わり目には、着火性を良くするために別な火薬が掛けられる。芯星も大きさが違うだけで、基本的には親星と似たような構造をしている。芯星の場合は、牡丹物のように１色のみか、２色に変るくらいが一般的。 導火線 寒天培地のイメージ図 実際の花火の構造 今までにない明確な順序制御を可能に！

直列回路と並列回路の差 ちば 直列型 並列型 エラーが起きたら止まる。 エラーが起きても動く。＝追い越しがおこる ＝順番を追い越さない 6 4 5 2 3 1 ちば ０９ 6 エラーが起きたら止まる。 エラーが起きても動く。＝追い越しがおこる ＝順番を追い越さない

ご清聴ありがとうございました。