海洋生命・分子工学基礎実験 タンパク質の取扱い (4) 細胞分子工学研究室担当
5.SDS-ポリアクリルアミド ゲルの調製
まずは・・・ ゲル板を組み立てる 当日実演します メモの用意を!
使う溶液 1. A 液 (30% アクリルアミド水溶液) 2. B 液 (Lower Gel Buffer) 3. C 液 (Upper Gel Buffer) 4. D 液 (10% 過硫酸アンモニウム ammonium peroxodisulfate = APS) 5. E 液 (10% テトラメチルエチレンジアミン tetramethylethylenediamine = TEMED)
分離ゲル (separation gel = running gel) 以下の溶液を混ぜる(12.5% アクリルアミド) A 液: 3.47 mL (3470 mL) B 液: 2.08 mL (2080 mL) 蒸留水: 2.78 mL (2780 mL) ここまで混ぜたら脱気 D 液: 28.5 mL E 液: 85 mL D 液と E 液を加えたらすばやく混ぜてゲル板に流し込む
分離ゲル (separation gel = running gel) ガラス板に流し込んだら,上に静かに水飽和 1-ブタノールを 載せる 1-ブタノールはアクリルアミド水溶液とは混ざらない ゲルの上の端が平らになるように約 30 分静置してゲルを固 める 固まったらブタノールを捨て,水道水→蒸留水で洗う 残った水をろ紙で拭き取る
濃縮ゲル (stacking gel) 以下の溶液を混ぜる A 液: 375 mL C 液: 625 mL 蒸留水: 1.5 mL (1500 mL) ここまで混ぜたところで脱気 D 液: 7.5 mL E 液: 50 mL D 液と E 液を加えたらすばやく混ぜてゲル板に流し込む
濃縮ゲル (stacking gel) 気泡を閉じ込めないように,サンプルコウムを差し込む 30 分間ほど静置し,ゲルを固める 固まったら,サンプルコウムとシールガスケットを取り外し, 水でぬらしたキムワイプと一緒に,ラップで包んで冷蔵保存 する(数週間は保存可能)
サンプルの調製 SDS サンプルバッファー 10% (w/v) グリセリン 5% (v/v) 2-メルカプトエタノール 2.3% (w/v) SDS 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8) 当日は上記のサンプルバッファーの 2 倍濃縮ストック溶液を 使用します(次のスライド)
2x SDS サンプルバッファー のつくり方 以下のものを混ぜて 10 mL とする 50% グリセリンを 4 mL SDS の粉を 0.46 g 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) を 2.5 mL 蒸留水を 2.5 mL 少量のブロモフェノールブルーの粉を溶かす