川崎病病原体としての －L型菌と野生型ではどちらが多くの ヒアルロニデースを産生するか－ 化膿レンサ球菌Ｌ型菌の検討 －L型菌と野生型ではどちらが多くの ヒアルロニデースを産生するか－ 1

１ 【目的】 　川崎病の病原体として化膿レンサ球菌Ｌ型菌を検討する。川崎病の病態は溶連菌感染症に似るため、当初から化膿レンサ球菌は原因菌として検討されたが、患者から本菌やそのL型菌、抗SLO抗体、抗SK抗体等も検出されないことなど、現在、否定的見解も多い。 　我々は第79回本学会西日本地方学術集会において、L型菌化した化膿レンサ球菌ではストレプトリジンOとストレプトキナーゼを産生しない株（124 L 株）があることを報告し、川崎病の原因菌として本菌のL型菌を更に検証する必要があることを指摘した。 　そこで今回は、ストレプトリジンOとストレプトキナーゼの産生に関しては、124L株の親株124株の結果を追加して報告し、更に野生型とL型菌のヒアルロニデース産生量を比較する。

【方法】 ２ 菌　株　 　L型菌は124 L株、野生型は124株（帝京大学・西山彌生博士より分与）、K5866株、K6274株、K6169株（鹿児島大学・西順一郎博士より分与）を用いた。 ストレプトリジン0とストレプトキナーゼの産生の比較 　ストレプトリジン0の溶血反応の観察は2つの方法（①、②）を用いて行った。①はＬ型菌用液体培地（0.5% yeast extract, 4% NaCl, 10% FBSを加えたbrain heart infusion broth ）、②は羊血液寒天培地（日水製薬）に滅菌飽和食塩水1.5mlを加え（浸透圧調製のため）37℃で乾燥させた培地を用いた。培養は共に好気と嫌気培養を行い、血液寒天面の溶血帯を調べた。SLO、SK酵素産生の確認には、全菌体成分に対する、抗SLO抗体（ＡＢＳ社　ＨＡＢ003）を用いたウエスタンブロッティングと抗SK 抗体（ＡＣＲ社　ＢＰ988）を用いたドットブロッティングを行った。 　 ヒアルロニデース産生の比較 　培養は、Ｌ型菌用液体培地（0.5% yeast extract, 4% NaCl, 10% 胎仔ウシ血清 を加えたbrain heart infusion broth ）で静置培養や嫌気培養を37℃で48時間行った。ヒアルロニデースの産生量の比較は、同一条件下で超音波破砕した全菌体成分に対する抗hyaluronidase polyclonal抗体（NOR社　NE076/7S）を用いたウエスタンブッロティングによって行った。

化膿レンサ球菌の野生型と そのL 型菌 ２ 野生型 L 型菌 (１２４ L株） ２μｍ ２μｍ 野生型の菌に対しまして、 このように 近ずいて見ないと、何にも見えないほど ばらばらの、小さい粒子になっています。 この１２４L株は、江田先生らによって、１９７２年に、臨床分離株の溶連菌より、作成されたL型菌で、長期間、継代され、安定型のL型菌になっています。 L型菌になると細胞は小型化し、培養条件によっては大型化もする。通常大小の細胞が混在し、 buddingによって極微小な顆粒状の細胞も多量につくられる。 L 型菌１２４ L 株の由来：　８２の臨床分離株より１３株のL型菌株が作 成され、継代に成功した安定型L型菌株（横浜市大・江田ら､１９７２年）

化膿レンサ球菌の L 型菌１２４ L 株 0.05 μｍ～数μｍの菌体が見られる ４ 1μｍ 走査電顕で見た、124Ｌ株の像です。 このように、１００ナノメーター以下のサイズから、数ミクロンのサイズまで 極端に異なるサイズの細胞が混ざっています。 1μｍ 0.05 μｍ～数μｍの菌体が見られる

ヒト赤血球に対する溶血反応（嫌気培養と好気培養） ５ 実験①　　 化膿レンサ球菌 L 型菌１２４ L 株の ストレプトリジンO 産生の確認 ヒト赤血球に対する溶血反応（嫌気培養と好気培養） Ｌ型菌は通常の血液寒天培地では増殖しない 液体培地でＬ型菌を増殖させ、溶血の有無を観察する まず、このＬ型菌のストレプトリジン０の産生を確かめるため、 血液寒天培地で、溶血を見る実験をいたしました。 このL型菌株は、市販の血液寒天培地には、生えてきませんので、 この様に まず、容器内に斜面培地のような血液寒天培地を作り、 ここに、L型菌用の液体培地を入れて、 ここで、L型菌を培養し、 この部分の溶血反応を見て見ることにしました。 嫌気培養を行って、SLOの産生を見ています。 血液寒天培地 L型菌用液体培地

１２４L 株には溶血帯（ ）が見られなかった (好気培養結果も同様） ６ 野 生 型 L 型 菌 Control K5866 K6169 　結果　（嫌気培養）　　　　　　　　 野　生　型 L　 型　菌 Control K5866 K6169 124 L その結果です。 このように 野生型の　この２株では、培養液が接した部分に このような、溶血帯が観察されました。 一方、菌を接種していない、このコントロールと　124Ｌ　L型菌のこの株では 溶血帯が見られませんでした この培養した液体培地を回収して遠心して見ますと、 １２４L 株には溶血帯（　　）が見られなかった (好気培養結果も同様）　　　　　　　　　

124 L株の増殖を確認、溶血による培地の赤変がなかった ７ 結果　　回収された菌体と培養液 K5866 K6169 124 L 菌体 培養液 野　生　型 L 型菌 このように、 L型菌も増殖しているのが確認されます。 L型菌の場合は、どうしても、菌体の収量は　野生型に比べて、少なくなります 上清の培養液を見ますと、 こちら、野生型が、溶血によって、赤くなっているのに比べて、 L型菌の方は、元の培地と変わらない色をしていまして、 このことからも、溶血が起こっていないことが、示されています。 124 L株の増殖を確認、溶血による培地の赤変がなかった

c a b 結果 １ 化膿レンサ球菌L型菌１２４L株の好気培養による羊血液寒天培地（3.5％NaCl）での溶血反応 ８ 菌の増殖が分かる角度で撮影　　溶血帯を示す透過光で撮影 a: K6169株, 　　　b: 124P株 , 　　　c:124L株 好気培養で１２４L株には溶血帯が見られなかった

b c a 結果 ２ 化膿レンサ球菌L型菌１２４L株の嫌気培養による羊血液寒天培地（3.5％NaCl）での溶血反応 ９ a: K6169株, 　　　b: 124P株 , 　　　c:124L株 菌の増殖が分かる角度で撮影　　溶血帯を示す透過光で撮影 嫌気培養でも１２４L株には溶血帯が見られなかった

結果 化膿レンサ球菌L型菌１２４L株のストレプトリジンO産生に関するウエスタンブロッティング解析 10 結果 　　 化膿レンサ球菌L型菌１２４L株のストレプトリジンO産生に関するウエスタンブロッティング解析 Anti-streptolysin O mouse monoclonal antibody　(1：250希釈） ９４K・ ６７K・ SDS-PAGE 　　K6169 124 L 　　K6169 ９４K・ ６７K・ ウエスタン・ブロッティング 124 L K6169株 ドット・ブロッティング 124 L 次に、 L型菌の菌体成分中に SLO　蛋白があるか、という事を確かめるため、 嫌気培養した、菌体をソニケーションで破砕し、全菌体成分中にある SLO蛋白を抗SLO抗体を用いて、ウエスタンブロティングを 行いました。 こちらが、SDS-PAGEを転写して、ポンソー液で染めたものです。 コントロールとして、この野生型を、用いました。 こちらが、ウエスタンブロッティングの結果が、 野生型では抗ＳＬＯ抗体に反応した６９Ｋの バンドが確認されますが このＬ型菌株では、バンドが確認されませんでした。 こちらの、ドットブロッティングでも、このＬ型菌株では反応が見られず、 この124Ｌ株ではＳＬＯが産生されていなものと思われました。 １２４L株には抗ＳＬＯ抗体に反応するバンド、ドットが見られなかった

結果 化膿レンサ球菌 L 型菌１２４ L 株のストレプトキナーゼ産生に関するドットブロティング解析 11 結果　 化膿レンサ球菌 L 型菌１２４ L 株のストレプトキナーゼ産生に関するドットブロティング解析 Anti-streptokinase rabbit polyclonal antibody　(1：12000希釈） K5866 株 　 　　K6169 株　　 124 L 株 野　生　型 L　型　菌 次に、 ストレプトキナーゼを見てみました。 この抗体では、ウエスタンブロッティングがあまり、うまくいきませんでしたが、 ドットブロッティングでは、このように、 こちらの　野生型に比べて、 　Ｌ型菌株では、抗体への反応が見られませんでした。 これらの結果から、 このＬ型菌124Ｌ株ではＳＬＯ・ＳＫ　ともに産生されていなものと思われました。 １２４L株には抗ＳＫ抗体に反応するドットが見られなかった

野生型と L 型菌のヒアルロニダーゼ産生量の比較 12 野生型と L 型菌のヒアルロニダーゼ産生量の比較 Anti－sheep　hyalunonidase polyclonal rabbit IgG(NOR)によるウエスタンブロティング解析 ９４ｋ ６７ｋ ４３ｋ K５８６６株 K６１６９株 １２４ L 株 ６７ｋ ４３ｋ ３０ｋ １２４P 株 K６２７４株 １２４ L 株 本培養条件ではL型菌の抗ヒアルロニダーゼ抗体に反応するバンドは野生型より濃厚であった

13 【結果と考察】 　　ストレプトリジン０産生の比較では、野生型４株には溶血帯と、抗SLO蛋白に反応するバンドやドットが見られたが、Ｌ型菌124Ｌ株では、好気、嫌気培養共に溶血帯が見られず、抗SLO抗体に対する反応も見られなかった。また、抗SK抗体に反応するドットも見られなかった。この結果から、化膿レンサ球菌がＬ型菌化すると、これらの酵素を産生しない株が出現する可能性が示唆された。 　ヒアルロニデースの産生を調べたウエスタンブロッティングの結果では、 124L株は、124L株の親株を含む4株の野生型より明瞭に濃厚なバンドが見られ、L型菌化すると野生型よりヒアルロニデース産生量が増加する可能性が示唆された。 　病原細菌がＬ型菌化すると、一般的に病原性は減弱する傾向がある。しかし、病原性が弱くなる事によって原因不明の疾患になる可能性もあると考え、その一つとして、川崎病を検討した。今回のL型菌株の様な化膿レンサ球菌L型菌が原因であるなら、抗SLO 抗体、抗SK抗体が患者から検出されない事も理解され、また、ヒアルロニデースが種々の症状に関連している可能性もある。川崎病患者組織からは、Ｌ型菌様の微生物も観察されるなど、他にもＬ型菌が疑われる知見があり、今後、更に川崎病の病原体としてL型菌を検討する必要があると思われた。

考察 なぜ L 型菌化すると SLO を産生しなくなるか 野生型 L　型　菌 不安定型 L 型菌 安定型 L 型菌 細胞壁なし 減少又は消失 ペリプラズム蛋白 完全な細胞壁 不完全な細胞壁 なぜ、SLOを産生しなくなるか、と言うことを、考察しますと、 我々は、スパイロソームや、HSP60、がペリプラズムにある、と考え、 L型菌になると、これらの蛋白は、どうなるか、ということを、観察してきました、 SLOもペリプラズムで最も活性が高く、そこに局在するとう論文がありましたので、今回調べて見たわけです。 これまでの観察で、ペリプラズムにあると、考えられました、 スパイロソームや、HSP60、で、 いずれも、同じ菌種内で、それを持つL型菌株と持たないL型菌株があ あることがわかりました。 そして、その蛋白を　持つL型菌は　形が、このような、不定形で、親株に復帰できる不安定型のL型菌で、 一方、 そのl蛋白を持たないL型菌は、完全な球形で、親株に復帰できない 安定型L型菌という傾向がありました。 L型菌でも、細胞壁成分を持っているものがある事も知られていますので おそらく、この様な、順序で、安定型L型菌になっていくと思われます。 そして、ほとんど、細胞壁がなくなりますと、ペリプラズムという部屋がなくなり、そこに蛋白を保持できないとう状態になって、ペリプラズムの蛋白を作らなくなっていくのではないかと考えられます。ストレプトリジン0も、このような経過で、安定型の124L株では消失したものと思われます。 ペリプラズム蛋白量　 やや減少又は 大量に産生される可能性 正常値 L 型菌には細胞壁成分の存在が報告されているものもあり、図の様な状態で漏出によりペリプラズム蛋白が過度に産生されたり、細胞壁を完全に失なった場合にはペリプラズム蛋白の減少や消失が起こるものと考えられる。

参考 川崎病 川崎病で化膿レンサ球菌が否定される点 １．患者検体から、溶連菌も、そのL型菌も分離されない ２．川崎病患者回復期血中のASLO値、ASK値が上昇しない ３．ペニシリン系の抗生剤が無効 川崎病は当初から、溶連菌が疑われていて、 その主な要因として、 このような、事があげられています。 一方、 それが否定される要因としては、 菌が患者から分離されない、Ｌ型菌も１６検体ほど調べた結果はネガティブであったということが報告されています。 また、アスロ値やＡＳＫ値が上昇しない、 ペニシリンが効かない、 といった点などがあげられています。 今回の結果から、 １２４Ｌ株のようなＬ型菌であれば、 この２と３が消せますので、

川崎病でL型菌が疑われる点 １．グラム陰性菌様、リケッチア様、 Ｌ型菌様、と形容され る微小粒子が、患者の急性期血液、発疹部の皮下組織 １．グラム陰性菌様、リケッチア様、　Ｌ型菌様、と形容され 　る微小粒子が、患者の急性期血液、発疹部の皮下組織 　冠状動脈瘤部､心筋炎部などに観察（電子顕微鏡）さ 　れており、Ｌ型菌の細胞表面の形態や、大小の細胞が 　ある点などが類似している。 ２．ペニシリンが無効である。 ３． L 型菌は通常の菌に比べ分離培養が困難である。 墓に、Ｌ型菌が疑われる 点を探って見ますと、 患者の検体から、Ｌ型菌に良く似た形態の、非常に小さい粒子が 観察されています。

川崎病患者から検出された細菌様微小粒子 川崎病 Caterら､１９７５ 川崎病 Uenoら､１９８３ 川崎病 Uenoら､１９８３ 血液 脾臓炎病巣部 川崎病　Uenoら､１９８３ 川崎病　濱島ら、１９８５ このような電顕写真が報告されていますが、 いずれも、硬い細胞壁のような構造はみられず、 そして、粒子のサイズが一定していない、 かなり、小さい粒子も見られる、といった点がＬ型菌に、にていいるところです 血液 発疹部の皮下組織

川崎病 （Uenoら １９８３） L型菌１２４L株 （江田ら、１９７９） 細菌様微小粒子 Ｌ型菌 川崎病　 （Uenoら　１９８３） L型菌１２４L株 　（江田ら、１９７９） １μｍ 細菌様微小粒子 Ｌ型菌 こちらは、江田先生らが報告した、Ｌ型菌の１２４Ｌ株で。 こちらは、川崎病患者の血漿中に見られた、粒子です、 この論文では、こちらは血小板と解釈されて、この粒子が Ｌ型菌様の粒子となっていますが、 このように、細胞に中に、娘細胞ができるのもＬ型菌の特徴ですから、 これもＬ型菌ではないかを私はおもいますが、 いずれにしても、この形態は似ております。 川崎病患者の細菌様微小粒子とＬ型菌は形態的に近似している